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作 者

周德志、竇博瀚、Florian Kroh、王楚芊、歐陽禮亮

機 構

清華大學

Citation

Zhou D Z, Dou B H, Kroh F, Wang C Q, Ouyang L L. 2023. Biofabrication strategies with single-cell resolution: a review. Int. J. Extrem. Manuf.5042005.

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https://doi.org/10.1088/2631-7990/ace863

撰稿 | 文章作者

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文章導讀

自然界中生物功能的多樣化與其復雜的異質結構和成分高度相關。作為一門跨學科生物技術，生物制造將活細胞引入制造過程，使得體外構建復雜生物組織及生命系統成為可能。常用的生物制造方法是對生物材料進行一體式（bulk）成型制造，但是該方法較難實現微觀細節和組分的可控分布。基于模塊化組裝的生物制造方法基于離散-組裝的制造思想，使用細胞、生物材料及其結合體作為構建單元來組裝所需的圖案或結構，能夠實現復雜的異質結構制造。近年來隨著技術的發展，實現具有單細胞分辨率特征的組織結構的制造已成為可能，大大提高了體外生理/病理組織模型構建的精度和仿生性。近期，清華大學機械工程系的歐陽禮亮團隊在《極端制造》期刊（International Journal of Extreme Manufacturing, IJEM）上發表《單細胞分辨率生物制造策略》的綜述，系統介紹具有單細胞分辨率的生物制造策略的研究背景、最新進展及未來展望。第一作者為博士生周德志，其他作者包括研究生竇博瀚、Florian Kroh和王楚芊。圖1展示了按構建單元維度分類的具有單細胞特征的生物制造技術，其中包括分別對應“點、線、面”三種維度的0D單細胞液滴/微球、1D單細胞纖維和2D單細胞片。

關鍵詞

細胞構建單元；模塊化組裝；單細胞分辨率；體外模型；再生醫學

亮 點

• 全面綜述了具有不同維度單細胞特征的生物制造方法及其最新進展；

• 強調了單細胞分辨率的生物制造作為基于細胞群生物制造的補充策略的優勢；

• 討論了跨尺度構建單元的模塊化組裝策略在大尺寸、單細胞特征的高階復雜異質結構制造的挑戰和應用前景。

圖1單細胞分辨率構建單元的分類及其代表性生物制造技術。

2

研究背景

通過在細胞尺度上觀察人體組織/器官結構，可以發現這些結構表現出具有低至單細胞水平的精細特征結構（圖2）。例如，胰島由至少五種類型的細胞組成，這些細胞在幾個細胞尺寸的維度內形成局部空間連接，這些緊密有序的結構允許細胞間相互作用來維持血糖穩態；骨骼肌是一種典型的各向異性組織，由肌纖維組成的肌束（單細胞精度級別）在神經支配下通過松弛和收縮之間的轉換表現出正常的肌肉功能；肺泡具有單細胞特征的氣-液界面，為保證氣體的交換效率提供了充足的面積（100-140平方米）。這些具有單細胞特征的異質結構對天然組織中的功能至關重要。然而，當使用細胞群作為構建單元時，很難在體外還原這些精細特征。在這些工程化細胞微環境中，細胞自組裝的過程進一步增加了精確還原天然微環境異質結構的難度。另一方面，由于同一細胞群內存在異質性，也需要開發具有單細胞分辨率的高通量平臺來促進單細胞分析的探索。因此，開發具有單細胞分辨率的生物制造策略對于促進體內和體外組織工程的應用具有重要意義。在本文中，作者對單細胞分辨率生物制造策略的最新進展進行了系統和詳細介紹。

圖2人體內具有單細胞特征的代表性組織/器官。

3

最新進展

單細胞分辨率生物制造是指可以制造具有單個細胞特征的工程化生物學產品的技術。例如，通過單細胞捕獲或單細胞打印，可以實現對單細胞分離和沉積的精確可控，構建單細胞模型進行單細胞分析和細胞行為研究。單細胞纖維的組裝也可用于肌肉和神經等各向異性組織的精確制造，而單層細胞片的組裝可用于多層組織制造。這些單細胞特征的構建塊可被視為基本單元，通過有序組裝以構建高階異質結構。因此，根據最小構建單元的維度，我們將具有單細胞分辨率的生物制造策略分為三種類型，即0D（單細胞液滴/微球），1D（單細胞纖維）和2D（單細胞片）。圖3展示了基于細胞群和單細胞兩種分辨率的構建單元。同維度下，單細胞結構單元的分辨率更好，但通常情況下，細胞群構建單元的穩定性更強。

圖3展示對應“點、線、面”三種維度下，基于細胞群和單細胞兩種分辨率的構建單元。

單細胞0D構建單元從細胞群中分離單個細胞是獲得0D構建單元的第一步。目前實現單細胞分離常用的技術可以分為界面屏障捕獲和無約束捕獲兩種，其中前者在捕獲細胞的同時完成了單細胞的圖案化，且無法改變單細胞的位置從而變化圖案形狀；后者因不受界面屏障的約束，因此可以在捕獲細胞后再次改變細胞的位置以實現圖案/結構形狀的變化。由于高精度和高通量的特點，噴射式打印技術已被應用于實現單細胞液滴的打印。微流控技術的引入可提高細胞液滴的可控性，通過反饋篩選系統實現包含單個或數個細胞的液滴生成。液滴式微流控技術與噴射式打印技術集成進一步提高了基于0D單細胞生物制造的能力。

圖40D構建單元技術:（a）模板法或表面改性法進行細胞選擇性捕獲；（b）基于不同力類型的細胞捕獲/組裝技術；（c）基于噴射式的單細胞液滴打印技術；（d）微流控技術生產和分選單細胞液滴。

單細胞1D構建單元定向性拓撲結構已被證明可以引導細胞伸展，因此精準構建具有單細胞分辨率的細胞纖維結構對各向異性組織工程化制造尤為重要。目前鑄模法和擠出法是常用于制造1D構建單元的辦法。其中鑄模法可通過改變微通道的圖案獲得相應的結構，但模具的精細結構不利于流動性差的溶液（如高細胞密度或高粘度材料）填充成型，且該方法在制造三維復雜結構上具有挑戰性。擠出法包括擠出式打印技術、靜電紡絲/近場直寫技術和濕法/微流體技術等。擠出式打印技術需要限制噴嘴的直徑來實現單細胞通過以獲得單細胞1D構建單元，但生物墨水的粘度提高會降低細胞的活性；靜電紡絲/近場直寫技術和濕法/微流體技術是通過施加外力來減少細胞纖維的直徑，因此對噴嘴的直徑限制較小。值得一提的是，按模塊組裝的策略，1D構建單元也可以通過沿同一方向連續排列組裝0D構建單元實現。

圖51D構建單元技術:（a）鑄模法依賴于具有單細胞特征的預制模具來限制細胞以形成細胞纖維；（b）擠出生物打印通過使用單細胞尺寸特征的微小噴嘴來生成單細胞纖維；（c）靜電紡絲/近場直寫通過電場拉伸生物墨水以產生單細胞纖維；（d）濕法/微流體紡絲通過引入轉子或同軸流以減小細胞纖維的直徑。

單細胞2D構建單元DLP光固化3D打印是通過動態掩膜逐層交聯光敏材料實現三維復雜結構制造的技術。目前該技術在Z軸上可以實現5μm分辨率的無細胞打印，但引入細胞后，分辨率約為50μm。生物墨水中的細胞會引起散射降低分辨率，因此未來需要對該技術進行更多地研究如優化光路來生成具有Z方向單細胞特征的3D結構。細胞片技術利于細胞自發形成緊密連接的單細胞層的現象，預先將細胞種植在熱敏、光敏等修飾基底表面或將磁化的細胞錨定在磁場中，待單細胞層形成后，通過變化溫度、加載光照或去除磁場等手段將單細胞層從基底表面剝離，從而得到單細胞片。該技術為生物制造提供了一種無支架2D構建單元制造策略。得到的單細胞片允許通過疊加、選擇和折疊等組裝方式形成高階結構。

圖62D構建單元技術:（a）DLP光固化生物打印技術，通過逐層光固化墨水疊加形成結構；（b） 細胞片技術的代表性技術及其細胞匯合和細胞片分離步驟；（c）通過組裝工藝制造高階細胞結構。

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未來展望

單細胞分辨率生物制造的應用具有單細胞分辨率的構建單元組裝是一種具有巨大潛力的策略，其可以工程化重建具有單細胞特征的生命系統。盡管早期的單細胞分離、操作技術主要用于細胞高通量篩選和單細胞分析，但最近研究顯示了單細胞構建單元空間組裝在細胞體外模型和再生醫學應用中的優勢。如在單細胞分辨率模型和細胞群模型之間發現了細胞行為的差異，這可能與細胞的固有特性和生物物理線索（例如拓撲結構和細胞外基質成分）有關。在再生醫學應用中，這些單細胞生物制造技術也可以通過組裝用于組織/器官修復的1D和2D單細胞構建單元來制造無支架和高密度細胞結構。不同類型的單細胞可作為0D單細胞構建單元用于直接組裝類器官，形成具有成熟功能或大尺寸的高階類器官，減少干細胞自組裝形成類器官的不可預測行為。配合如單細胞分析、篩選和機器學習技術，有望可以選擇性組裝細胞形成類器官，這可能是提高其可控性，可重復性的替代方法。

跨尺寸構建單元的共組裝力學性能是單細胞生物制造技術的主要挑戰。通常，單細胞生物制造獲得的生物結構由于結構精細、沒有足夠的材料支撐，而無法滿足植入要求。雖然細胞片已被證明可作為植入物，但這些工程植入物仍難以在體內維持結構。因此，跨尺寸構建單元的共組裝是制造符合力學需求的異質結構的替代方案，該組裝策略使用細胞群或生物材料構建單元組成力學支撐結構，而單細胞構建單元用于制造具有單細胞特征的精細結構。在模塊化組織的生物制造策略中，制造速度與組裝單元的尺寸和維度高度相關。因此，考慮分辨率和制造效率之間的平衡，為特定用途選擇合適的構建單元對提高制造效率是有幫助的。簡而言之，單細胞、細胞群、生物材料的構建單元的共組裝策略有望提高大尺寸生命系統的分辨率和制造效率。

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作者簡介

歐陽禮亮

清華大學

歐陽禮亮，清華大學機械工程系副教授、博士生導師。獲得清華大學工學學士（2012）和工學博士（2017）學位，先后在賓夕法尼亞大學和帝國理工學院從事訪問研究和博士后研究。長期從事生物3D打印技術、材料及應用研究，聚焦于設計和制造使能性生物墨水，應用于功能性組織器官模型的構建。發表生物3D打印相關英文專著及SCI論文，所載期刊包括《Science Advances》《Advanced Materials》等。擔任國際生物制造學會（ISBF）青年學者委員會委員，《Biofabrication》期刊編委，《International Journal of Bioprinting》期刊副主編，《Biomaterials Advances》等期刊客座編輯, 《Adv Fiber Mater》和《BMEMat》期刊青年編委。榮獲“ISBF New Investigator Award”(2021)、“IOP Top Cited Author Award” (2018)等榮譽。課題組主頁：http://llouyang.com/

周德志

清華大學

周德志，清華大學機械工程系歐陽禮亮組博士生。目前在研課題為利用生物3D打印技術構建各向異性復雜結構，應用于如心肌、骨骼肌的組織構建與再生修復。

3D/4D打印生物壓電智能支架用于下一代骨組織工程

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關于期刊

International Journal of Extreme Manufacturing(中文《極端制造》），簡稱IJEM，致力于發表極端制造領域相關的高質量最新研究成果。自2019年創刊至今，期刊陸續被SCIE、EI、Scopus等20余個國際數據庫收錄。2023年JCR最新影響因子14.7，位列工程/制造學科領域第一。中科院分區工程技術1區，TOP期刊。

?? 期刊宗旨和欄目（點擊閱讀詳情）

期刊網址：

https://iopscience.iop.org/journal/2631-7990

期刊投稿：

https://mc04.manuscriptcentral.com/ijem-caep

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撰稿: 作者 編輯：范珂艷 審核：關利超

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