撰文丨章臺柳

有袋類動物與胎盤哺乳動物在 1.6 億年前分化，其獨特的胚胎發育模式為哺乳動物胚胎學提供了重要 參考 。 與有胎盤類動物相比，有袋類動物胎盤形成較晚，著床過程短暫。幼崽早產，在子宮外完成發育。和有胎盤類動物一樣，有袋類動物也會發生X染色體失活（XCI）。然而，它們缺乏有胎盤類動物啟動 XCI 的非編碼 RNA Xist ，而是由 另一種非編碼 RNA RSX 介導 。此外，在有胎盤類動物中，體細胞的 XCI 是隨機的，但在有袋類動物中 XCI 是印記性的，父源 X 染色體總是被選擇沉默【1】。

目前尚未有研究 對有袋類動物著床前胚胎進行表觀基因組分析。在有胎盤類動物中， DNA 甲基化會在全基因組范圍重編程，且與胚胎發育關鍵事件相關。在有胎盤類動物中，父源基因組在受精后發生主動去甲基化。隨后，父源和母源基因組發生被動去甲基化，導致早期囊胚出現全基因組低甲基化。在非哺乳類脊椎動物中未觀察到 DNA 甲基化的全基因組擦除現象，這一過程 被認為是 哺乳類動物特有 的【2】（例如，允許早期胚胎基因組激活（ EGA ）、擦除父源甲基化和表觀突變、滋養外胚層的形成、建立或調控胚胎發育的轉座子表達）。這些胚胎發育的關鍵節點在有袋類動物中經歷的時間更長，這使其成為研究 DNA 去甲基化在哺乳動物胚胎發生中作用的有用替代模型。有袋類動物擁有脊椎動物核心的 DNA 甲基化機制，包括從頭甲基轉移酶基因（ DNMT3A 和 DNMT3B ）、 DNMT3L 、 TET1-3 、 UHRF1 以及兩個維持性甲基轉移酶基因（ DNMT1A 和 DNMT1B ）。然而，配子中的 DNA 甲基化狀態以及著床前發育過程中的情況尚未被探究。

近日 ， 來自 英國 弗朗西斯·克里克研究所 的 James M. A. Turner 和 Bryony J. Leeke 團隊 合作 在 Nature 雜志上發表文章 Divergent DNA methylation dynamics in marsupial and eutherian embryos ，通過繪制有袋類動物——負鼠配子、胚胎及成年組織的單堿基分辨率DNA甲基化圖譜，揭示其與胎盤類動物模型的差異。與有胎盤類動物相比，負鼠卵母細胞和精子的DNA甲基化水平差異較小。此外，負鼠基因組在卵裂期與胎盤類不同，維持高甲基化狀態。在囊胚期，上胚層的 DNA 去甲基化短暫且溫和，而在滋養外胚層持續進行，這表明 DNA 低甲基化在哺乳動物胎盤發育中可能具有進化保守功能。另外，與胎盤類動物不同，負鼠胚胎發育過程中失活X染色體整體呈DNA低甲基化，并揭示了印記X染色體失活的可能機制——通過母源DNA甲基化調控類似Xist的非編碼RNA——RSX。即 在進化上存在差異的有胎盤類和有袋類動物，在胚胎發育過程中對 DNA 去甲基化的利用方式不同。

為了研究有袋類動物胚胎發生過程中的全基因組甲基化情況，研究人員 從負鼠精子、卵母細胞以及胚胎發育第（ E ） 1.5 天至 E7.5 天每日采集的雄性和雌性著床前胚胎中制備了低起始量亞硫酸氫鹽測序（ BS-seq ）文庫，同時還采集了代表三個胚層的成年體細胞組織 。胚胎樣本 涵蓋了胚胎基因組激活（ EGA ， E3.5 ）、 X 染色體失活（ XCI ， E3.5 ）、囊胚形成（ E5.5 ）以及滋養外胚層和上胚層譜系分化（ E6.5 和 E7.5 ）等時間節點。 首先， 精子和腦組織呈現高甲基化和雙峰甲基化模式，囊胚則表現為全基因組低甲基化（精子平均甲基化水平為 76% ，腦組織為 71% ，囊胚為 16% ； ），這些發現與已發表研究相一致。其次， 與有胎盤類動物一樣，負鼠精子基因組相對卵母細胞呈高甲基化狀態 ，但兩者的差異幅度較小， 精子平均甲基化水平為 77% ，卵母細胞為 65% 。因此，負鼠卵母細胞的甲基化水平與體細胞組織相近（腦、肝和脾的平均甲基化水平分別為 72% 、 69% 和 55% ）。此外，負鼠受精后，基因組仍保持相對高甲基化（平均甲基化水平為 62.5% ）。胚胎發育第 1.5 天（ E1.5 ）的甲基化組與卵母細胞更為相似，這表明精子中的一些位點發生去甲基化并重新編程為類似卵母細胞的狀態 。雖然 如此， 但 早期胚胎的高甲基化水平表明，負鼠并未出現有胎盤類動物典型的全基因組 DNA 甲基化缺失現象。高甲基化狀態一直持續到胚胎發育第 4.5 天（ E4.5 ），此時平均甲基化水平為 64% 。隨后，在囊胚期，甲基化水平最初在 E5.5 降至 54% ，在 E6.5 降至 45% ，之后在 E7.5 回升至 49% 。 因此，與有胎盤類動物不同，負鼠的胚胎基因組激活和卵裂發生在高甲基化基因組的背景下。

在負鼠中，譜系分化始于胚胎發育第 6.5 天（ E6.5 ）。為確定整體分析所顯示的甲基化水平降低是影響所有細胞還是特定譜系， 研究人員 對分離出的 E7.5 胚胎盤（包含上胚層（ EPI ）和原始內胚層）和滋養外胚層進行了 BS-seq ，發現 胚胎盤的甲基化水平（ 63% ）高于滋養外胚層（ 4 7% ）。進一步的單細胞多組學分析顯示， 當胚胎從 E5.5 發育到 E6.5 時，上胚層和滋養外胚層均觀察到甲基化降低。隨后，在 E7.5 ，上胚層的甲基化水平升高，而滋養外胚層繼續降低。滋養外胚層的甲基化水平與有胎盤類動物著床后胚外組織的情況類似 。 因此，與有胎盤類動物相比，負鼠的 DNA 去甲基化發生較晚，在上胚層是短暫且適度的，而在滋養外胚層則持續進行。胚外組織的低甲基化水平和部分甲基化結構域的形成是有袋類和有胎盤類哺乳動物的保守特征。 對甲基 化相關酶 的基因表達進行分析，發現 DNA 甲基轉移酶（ DNMT ）的表達差異可能是導致上胚層（ EPI ）和滋養外胚層呈現不同 DNA 甲基化模式的原因。

隨后，研究人員對負鼠卵母細胞和精子的差異甲基化區域（ DMR ）進行探究，共鑒定出 20,800 個精子特異性 DMR 和 22,921 個卵母細胞特異性 DMR 。與有胎盤類動物一樣，卵母細胞 DMR 在基因內區域和 CpG 島中相對富集，而精子 DMR 則在基因間區域富集。 對負鼠卵母細胞的 DNA 甲基化模式進行分析，發現 非轉錄區域甲基化水平極高。與人類一樣，負鼠卵母細胞中 DNMT3L 不表達，這表明負鼠卵母細胞中的從頭 DNA 甲基化不依賴于 DNMT3L 。與有胎盤類動物卵母細胞一樣，負鼠卵母細胞中非 CpG 甲基化相對富集，這表明該特征在獸類哺乳動物中是保守的 。

在有胎盤類動物中，活性X染色體（Xa）和失活X染色體（Xi）呈現出不同的 DNA 甲基化模式。在染色體整體水平上， Xi 的甲基化程度略低于 Xa ，但 Xi 在 CpG 島（ CGI ）啟動子區域表現為高甲基化 。 相比之下，在有袋類動物中，Xi在CGI和轉錄起始位點呈現低甲基化。在成年負鼠組織中，雌性動物 X 染色體的 DNA 甲基化水 平約為雄性動物的一半 ，與另一種有袋類動物考拉的研究結果一致。進一步分析顯示，這是由于 沉默的父源 X 染色體低甲基化所致 。對 Xi 低甲基化建立的時間進行探究，發現 在精子和卵母細胞中， X 染色體的 DNA 甲基化水平相當 ； 在卵裂階段， Xi 的甲基化逐漸丟失，從囊胚階段開始，低甲基化狀態明顯。因此，胚胎發育過程中，不同染色體的甲基化水平存在差異，活性 X 染色體和常染色體保留甲基化，而 Xi 則失去甲基化。 對 XCI 的機制進行探究，發現一個包含 RSX 啟動子的差異甲基化區域（ DMR ），該區域在卵母細胞中高度甲基化，在精子中低甲基化 ，可能是印記 X 染色體失活的可能機制。

總的來說，研究描繪了有袋類動物早期發育過程中的DNA甲基化圖譜，并揭示了其與胎盤類動物模型的差異，為研究DNA甲基化在早期發育過程中的作用提供參考。

https://www.nature.com/articles/s41586-025-08992-2

制版人： 十一

參考文獻

1. Sharman, G. B. Late DNA replication in the paternally derived X chromosome of female kangaroos.Nature230 , 231–232 (1971).

2. Adalsteinsson, B. T. & Ferguson-Smith, A. C. Epigenetic control of the genome-lessons from genomic imprinting.Genes5 , 635–655 (2014).

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