堿基編輯器（base editors,BEs）是建立在CRISPR/Cas系統的基礎上發展起來的避免了DNA雙鏈斷裂的基因編輯技術【1-3】。兩類核酸脫氨酶—腺嘌呤脫氨酶和胞嘧啶脫氨酶作為功能蛋白與核酸酶缺陷型CRISPR蛋白共價融合來實現在基因組中的C:G到T:A（CBEs）或A:T到G:C（ABEs）的位點特異性轉換。堿基編輯技術已被廣泛應用于遺傳疾病治療的臨床實驗中。

然而，不同于腺嘌呤編輯器，胞嘧啶編輯器常常受限于其過寬的編輯窗口，較高的脫靶編輯效應以及更頻繁的插入刪除效應。此前已有相關工作報導了通過進化

E. coli

tRNA腺苷脫氨酶（TadA*），使其可以作為胞嘧啶編輯器使用4-6。但是部分TadA衍生的胞嘧啶編輯器仍有殘余的腺嘌呤編輯活性，編輯效率或者產物純度并不盡如人意。

同時，堿基編輯一直面臨著鄰位編輯（bystander editing）的問題，脫氨酶可在約4–10個核苷酸的編輯窗口內對堿基進行脫氨，對鄰近非目標堿基進行編輯，從而導致基因擾亂或引入錯義突變。

2025年6月27日，芝加哥大學化學系湯瑋欣課題組在Nature Biotechnology雜志上發表了題為High-precision cytosine base editors by evolving nucleic-acid-recognition hotspots in deaminase的文章，該研究通過巧妙地進化E. coliTadA的三個關鍵底物識別結構域（loop3-helix2-loop7），成功得到了底物特異性和天然胞嘧啶脫氨酶處于相當水平的TadA衍生胞嘧啶編輯器。同時，通過同時改造酶-底物互作結構域，該工作得到了對應十六種所有可能的NCN（N=A,T,C,G）偏好的一系列精準堿基編輯器。

為了實現對底物特異性的轉變，作者以高活性且本來就已經有可檢測的胞嘧啶脫氨活性的TadA8r出發【7】。利用之前開發的細菌抗生素抗性基因編輯的高通量篩選系統，作者成功得到了能同時脫氨A和C的雙功能堿基編輯器（Tad-CABE1s）。在此基礎上，通過對篩選以往進化TadA得到的有益突變的隨機組合，作者進一步得到了活性更高的胞嘧啶脫氨酶（Tad-CBE2.4）。進一步地，通過對與目標堿基+1位置相互作用的loop3進行飽和突變以及篩選，作者得到了基本無殘余腺嘌呤脫氨活性的胞嘧啶特異堿基編輯器（Tad-CBE3s）。相比其他已報道的TadA衍生胞嘧啶編輯器，Tad-CBE3s能夠實現幾乎無序列偏好性的C:G到T:A的轉變，同時基本消除了腺嘌呤編輯活性。

通過對前三輪進化的總結，作者發現在進化過程中，脫氨酶的底物序列偏好性亦會根據篩選目標序列被重塑。根據這一發現，作者從TadAC2.4出發，通過對和底物+1位置堿基相互作用的結構域同時進行飽和突變以及篩選，作者得到了對ACG特異編輯的Tad-CBE4.1。通過

E

. coli

體內編輯實驗，體外實驗以及哺乳動物體內編輯實驗，作者多方面確認了其 A C G 的底物偏好。

通過設計帶有15種剩下的NCN靶標序列的篩選體系，并同步對脫氨酶中識別堿基–1與+1位點的結構域實施突變與篩選，作者成功得到了對應16種NCN序列組合的一系列不同序列偏好的脫氨酶。從

E

. coli

體內進化實驗看，進化得到的脫氨酶變體一般在編輯特異性上都得到了提升。從體外實驗看，作者用帶有多種 N C N 底物的噬菌體單鏈基因組作為底物，確認了脫氨酶的序列偏好性。進一步地，作者在包含 1 0099 個疾病相關位點的哺乳動物文庫中系統性地評估這些序列特異的胞嘧啶堿基編輯器的編輯效率與序列偏好性等。結果顯示，帶有序列偏好性的堿基編輯器在 81.5% 的位點上比已報道的 Tad-CBE2.4 ， Tad-CBE3.1 ， Tad -CBEd 和 r APOBEC1-BE4 具有更高的編輯精確度，意味著在大多數位點上，序列偏好的堿基編輯器產生的目標堿基被編輯的產物比例要高于已報道的其他堿基編輯器。

在此基礎上，作者將帶有序列特異性的堿基編輯器應用于兩個癌癥驅動突變—

K

RAS

G12D （ A C C ）以及

TP53

R248Q （ C C G ）的原代細胞模型構建實驗中。當存在鄰位編輯效應時，目標突變無法被準確插入，如

K

RAS

G12D 會出現 G13D/N, G12N, A11T 和 G10K 而

TP53

R248Q 會出現 R249K 和 M246I 。無序列偏好的胞嘧啶編輯器最高僅有 2 .9% 的編輯產物帶有目標的

K

RAS

G12D 突變，而當使用 ACC 偏好的 SpRY-Tad-CBE(ACC3) 時，有 2 1.1% 的編輯產物帶有正確的突變。相似地，在 TP53 上，無序列偏好的胞嘧啶編輯器最高只有 4 .4% 的預期產物。而當使用 CC G偏好的 SpRY-Tad-CBE(CCG3) 時，有 18.5% 的編輯產物帶有正確的突變。以上結果展示了序列偏好的胞嘧啶堿基編輯器在不同細胞系不同遞送方式的情況下進行高效、精準的基因組編輯的能力。

綜上所述，該研究通過改造酶-底物互作結構域，成功操控了脫氨酶的底物特異性與序列偏好性。實現了從天然的腺嘌呤脫氨酶到無殘余腺嘌呤脫氨活性的高效、寬泛序列兼容的胞嘧啶編輯器，進一步地，通過定向進化序列特異的脫氨酶，作者得到了一系列覆蓋16種所有NCN組合的序列特異的胞嘧啶編輯器，實現了在基因組上高效且精準，甚至于單堿基精度的C:G到T:A的轉變。

芝加哥大學湯瑋欣課題組的吳元博士研究生和肖玉蘭博士為本論文的共同第一作者，湯瑋欣教授為通訊作者。

https://www.nature.com/articles/s41587-025-02678-w

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