靈長類（獼猴）動物大腦神經細胞類型多樣、腦區結構復雜，是解析高等認知功能（如語言、決策、社會行為）的理想模型【1】。解析行為認知背后的神經環路是理解大腦工作原理的關鍵，而神經環路由不同細胞類型通過復雜聯接形成【2】，因此細胞類型特異性靶向技術是腦科學研究領域的重要手段【3,4】。在嚙齒類動物中，經典的Cre轉基因小鼠品系可用于實現神經細胞類型特異性的標記、神經活性調控及觀測，從而開啟了神經科學精細化研究的時代【4-6】。靈長類動物轉基因品系構建周期長、技術難度高、資源投入大，因此傳統的Cre轉基因策略有很大的局限性。增強子序列是調控基因特異性表達的關鍵元件，利用特定的增強子可以驅動外源基因在對應細胞類型中的表達【7,8】。然而，迄今為止，靈長類大腦神經細胞類型特異性增強子的鑒定與應用尚處于起步階段，建立能夠特異性靶向靈長類大腦不同細胞類型的增強子工具集成為領域的重大需求。

2025年7月10日，中國科學院腦智卓越創新中心/上海腦科學與類腦研究中心劉真研究組、腦智卓越中心孫怡迪研究組、臨港實驗室李昊研究組合作在Cell期刊在線發表了題為Identification and Application of Cell Type-Specific Enhancers for the Macaque Brain的研究論文。該研究率先建立了靈長類大腦神經細胞類型特異性標記、神經活性調控及觀測的工具集，為深入理解靈長類腦結構、腦認知及腦疾病提供了關鍵技術。

首先，研究團隊利用獼猴全腦單細胞轉錄組（SnRNA-seq）、空間轉錄組（Stereo-seq）及單細胞表觀組（SnATAC-seq）數據進行多組學聯合分析，建立了獼猴大腦細胞特異性增強子分析和預測流程，并獲得了獼猴不同神經細胞類型的一批潛在侯選增強子序列（圖一A）。針對靈長類大腦不同興奮性神經元、抑制性神經元和膠質細胞，研究團隊設計和構建了利用增強子靶向上述細胞類型的109種熒光報告載體（圖一B），并分別包裝為腺相關（AAV）病毒。為了鑒定真正高效特異的增強子序列，研究團隊建立了獼猴大腦通量AAV病毒注射和篩選流程（圖1C），并利用免疫熒光、單細胞測序、RNA Scope、CO染色、形態學分析等手段對109種AAV病毒的表達效率和靶向特異性進行了系統評估，最終鑒定得到能夠分別特異性靶向獼猴大腦不同層興奮性神經元（L2/3、L4、L5、L6）、抑制性神經元亞型（PV、SST、VIP）及膠質細胞亞型（星形膠質細胞、少突膠質細胞）的增強子序列（圖1D）。跨物種比較顯示部分獼猴增強子具有跨物種序列保守性與功能保守性（可在小鼠中靶向標記同樣的抑制性神經元及膠質細胞）。然而，針對獼猴皮層不同層興奮性神經元的增強子在小鼠中未能實現同等效力的靶向標記，這表明大腦順式調控元件存在進化差異。這一結果也提示，研究團隊發現的增強子元件更可能在人類中發揮相似的靶向功能，具有潛在臨床價值。此外，研究團隊還開發了基于重組酶（FRT/FLPo）的雙增強子正交策略，進一步提升了增強子標記策略的特異性和靈活性。

圖1.（A）獼猴大腦細胞特異性增強子多組學分析預測流程。（B）針對不同細胞類型篩選的潛在增強子序列總覽。（C）獼猴大腦增強子在體篩選及功能評估流程。（D）本研究鑒定得到的獼猴大腦皮層細胞類型特異性增強子。

基于上述研究，團隊在獼猴初級視覺皮層開展了細胞類型特異性光遺傳和鈣成像實驗，實現了PV神經元的特異性活性調控和SST神經元的特異性活性觀測，并初步探究了PV神經元的激活對局部微環路的影響（圖2A-B），揭示了SST神經元在不同視覺信息刺激下的發放模式（圖2C-E）。最后研究團隊利用上述特異性增強子構建了包含112種AAV載體的工具集，該工具集支持在靈長類動物中實現9種主要細胞類型的特異性標記、結構解析、靶向活性操縱與動態觀測。

圖2.（A）獼猴初級視覺皮層PV神經元光遺傳激活實驗示意圖。（B）一個被給光激活的代表性快速放電神經元示例。（C）獼猴初級視覺皮層SST神經元鈣成像示意圖。（D）使用雙光子實驗觀察局部SST神經元。（E）不同SST神經元針對顏色及朝向視覺刺激的鈣反應曲線圖。

綜上，該研究聚焦靈長類腦科學研究的迫切需求，搭建了包含數據處理、基因工程、探針改造、精細顱外科手術、生物工程、行為訓練、電生理記錄、光遺傳調控、鈣成像觀測的學科交叉團隊和研究體系，系統性地建立了靈長類大腦不同細胞類型特異性標記、神經活性調控及觀測的工具集（圖3）。該研究突破了傳統轉基因策略的局限，為深入探索靈長類腦結構、解析腦認知原理以及未來實現腦疾病的精準靶向治療提供了完整且強大的分子遺傳工具庫，標志著靈長類腦科學進入了精準細胞類型研究新階段。

圖3. 靈長類大腦細胞類型特異性標記、調控及觀測工具集的建立和應用。

中國科學院腦智卓越創新中心/上海腦科學與類腦研究中心劉真研究員、腦智卓越創新中心孫怡迪研究員、臨港實驗室李昊研究員為該論文的共同通訊作者。劉真研究組博士研究生李靈、陸登宇、研究助理傅吉強、臨港實驗室/上?？萍即髮W研究生黃奕銘為該論文并列第一作者。中國科學院腦智卓越中心蒲慕明研究員、劉賜融研究員、王立娜高級實驗師、李超博士、陳哲遠博士、廖海歐博士、李莉高級實驗師、顧天越、劉合安、唐儆、顏嘉琪，臨港實驗室李澄宇研究員、冷向晴、張家琪，上?？萍即髮W何芳，華大基因劉龍奇研究員，福建醫科大學黃華品教授、吳路燕也參與了本研究并提供了重要幫助。

劉真研究組致力于技術創新驅動的靈長類發育生物學和腦科學研究。研究組一個重點研究方向是靈長類腦研究分子遺傳技術的研發和應用。目前研究組已實現靈長類基因工程、探針改造、顱外科手術、生物醫學工程、行為訓練、電生理記錄、光遺傳調控、鈣成像觀測、多模態數據分析等技術的整合，建立了完備的靈長類學科交叉研究體系。未來研究組將長期致力于靈長類腦研究前沿技術開發，并推動靈長類大腦認知規律的解析和腦疾病的精準靶向干預研究。誠邀對靈長類腦認知和腦疾病研究感興趣，具有認知神經科學、計算機科學、生物醫學工程、發育生物學等相關專業研究背景的博士后加入。

https://doi.org/10.1016/j.cell.2025.06.040

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