引言

抗體與其靶抗原的結(jié)合動(dòng)力學(xué)是決定其生物學(xué)功能和作為新型生物治療藥物成功的關(guān)鍵因素。定義抗原抗體的相互作用和動(dòng)力學(xué)對(duì)于理解抗體在治療應(yīng)用中的藥理學(xué)和藥效學(xué)特征至關(guān)重要。

抗體的功能與其結(jié)構(gòu)直接相關(guān)，不同的結(jié)構(gòu)域能夠與抗原和免疫系統(tǒng)的其他元件相互作用。天然抗體由兩個(gè)片段抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域（Fab）和一個(gè)片段可結(jié)晶結(jié)構(gòu)域（Fc）組成。Fab結(jié)構(gòu)域包含互補(bǔ)決定區(qū)（CDR），其通過(guò)非共價(jià)相互作用介導(dǎo)抗體與靶標(biāo)的結(jié)合。傳統(tǒng)上，兩個(gè)抗體臂上的CDR是相同的，但目前已經(jīng)開(kāi)發(fā)出多種新的形式，包括雙特異性抗體、三特異性抗體、抗體偶聯(lián)藥物（ADC）和免疫細(xì)胞因子等。

精準(zhǔn)確定抗體結(jié)合相互作用是早期發(fā)現(xiàn)工作的關(guān)鍵，靶點(diǎn)的性質(zhì)和候選抗體的適應(yīng)癥應(yīng)用可能決定親和力要求和靶點(diǎn)作用機(jī)制。與小分子不同，抗體可以與幾個(gè)治療靶點(diǎn)（包括Fc受體）相互作用，導(dǎo)致免疫效應(yīng)細(xì)胞的募集和激活，直接消除表達(dá)靶抗原的細(xì)胞。抗體還可以通過(guò)模仿天然多價(jià)配體、驅(qū)動(dòng)受體聚集和反激活來(lái)誘導(dǎo)激動(dòng)作用。這些不同的作用機(jī)制和日益復(fù)雜的新型抗體形式的出現(xiàn)，使抗體親和力和功能效力之間關(guān)系的研究成為一項(xiàng)復(fù)雜的任務(wù)。

一、抗體結(jié)合親和力與功能性親和力

結(jié)合親和力（affinity）代表了兩個(gè)分子之間結(jié)合的緊密程度。它來(lái)源于結(jié)合和解離的速率，定義了復(fù)雜結(jié)構(gòu)的組裝和分解的速度。在抗體的背景下，靶結(jié)合親和力是指CDR與其抗原表位之間的相互作用，它來(lái)自抗體與靶標(biāo)解離速率常數(shù)（Koff）和結(jié)合速率常數(shù)（Kon）的比值。

結(jié)合親和力也可以來(lái)自其他抗體結(jié)構(gòu)域，如Fc區(qū)。由于這些恒定結(jié)構(gòu)域的高度序列同源性，相互作用強(qiáng)度通常是一致的，主要在抗體同種型或Fc受體多態(tài)性之間觀察到顯著差異。抗體對(duì)其抗原的親和力和特異性是由非共價(jià)相互作用驅(qū)動(dòng)的，包括氫鍵、范德華力和抗體CDR中氨基酸殘基介導(dǎo)的靜電相互作用。具有相似結(jié)合親和力的抗體可能具有不同的動(dòng)力學(xué)。因此，在考慮觀察到的治療效果時(shí)，了解影響KD值的個(gè)體動(dòng)力學(xué)速率常數(shù)是非常重要的。

由于抗體的二價(jià)形式，抗體同時(shí)與兩種不同的抗原結(jié)合，這一概念被稱為功能性親和力（avidity）。功能性親和力代表抗體-抗原相互作用的整體強(qiáng)度，受三個(gè)因素的影響——結(jié)合親和力（Affinity）、價(jià)數(shù)和抗體與抗原的結(jié)構(gòu)排列。功能性親和力來(lái)源于結(jié)合位點(diǎn)的共定位，抗體的兩個(gè)CDR結(jié)合到同一靶標(biāo)上，如細(xì)胞膜上的抗原。這可以表現(xiàn)為結(jié)合親和力的明顯增加，這是由增強(qiáng)的再結(jié)合潛力引起的，因?yàn)榈诙€(gè)Fab：抗原相互作用可以在主要復(fù)合物解離之前發(fā)生。

親和力增加可能出于兩個(gè)原因。首先，抗體的兩個(gè)臂都與空間相關(guān)的位點(diǎn)結(jié)合，為了完全解離，兩個(gè)臂必須釋放其抗原，導(dǎo)致有效的解離半衰期比單獨(dú)的抗體臂長(zhǎng)得多。其次，當(dāng)與細(xì)胞表面相關(guān)抗原結(jié)合時(shí)，抗體在空間上受到限制。一個(gè)潛在的后果是，第二次結(jié)合事件是由細(xì)胞表面上第二拷貝抗原的局部可用性來(lái)決定的。因此，功能性親和力可以被視為一種協(xié)同作用，其中一個(gè)臂的結(jié)合會(huì)導(dǎo)致另一個(gè)臂結(jié)合動(dòng)力學(xué)的變化。細(xì)胞膜上更高有效抗體濃度的親和力效應(yīng)將取決于細(xì)胞密度和抗原表達(dá)水平。

當(dāng)目標(biāo)是最大限度地提高靶參與度，以拮抗靶抗原的生物功能時(shí)，功能性親和力可能是有利的。然而，當(dāng)目標(biāo)指向免疫系統(tǒng)時(shí)，如ADCC和ADCP，這種抗體二價(jià)的作用是非常有限的。實(shí)驗(yàn)觀察表明，單價(jià)或具有較低內(nèi)在親和力的工程抗體可能更有效，表現(xiàn)出明顯增加的Emax，這是由于與細(xì)胞膜結(jié)合的抗體增加。

二、抗體-抗原相互作用的調(diào)節(jié)

近年來(lái)，人們已經(jīng)探索出幾種調(diào)節(jié)抗體靶點(diǎn)結(jié)合的方法。通過(guò)提高抗體親和力或改變價(jià)態(tài)并引入額外的功能域來(lái)實(shí)現(xiàn)抗體與靶點(diǎn)的更強(qiáng)結(jié)合。

抗體序列工程化調(diào)節(jié)抗體靶親和力

抗體親和力調(diào)節(jié)的最早時(shí)間點(diǎn)是在抗體發(fā)現(xiàn)階段。傳統(tǒng)上，抗體親和力的調(diào)節(jié)可以通過(guò)體外噬菌體、酵母和哺乳動(dòng)物基于展示的抗體發(fā)現(xiàn)模型來(lái)實(shí)現(xiàn)的。親和力調(diào)節(jié)可以通過(guò)使用這些方法進(jìn)行親和力成熟來(lái)實(shí)現(xiàn)，引入突變以產(chǎn)生具有操縱靶結(jié)合親和力的突變庫(kù)，此外，可以通過(guò)引入更苛刻的洗滌條件來(lái)選擇高親和力抗體。

此外，通過(guò)體內(nèi)技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)的高親和力抗體的發(fā)現(xiàn)。通過(guò)調(diào)節(jié)免疫方案，包括免疫抗原、佐劑、預(yù)處理、免疫方案、給藥途徑和靶生物的形式，以最大限度地刺激高親和力抗體的產(chǎn)生，然后通過(guò)B細(xì)胞克隆技術(shù)篩選高親和力抗體。進(jìn)一步的創(chuàng)新包括使用表達(dá)人源抗體的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，這些抗體能夠以高親和力結(jié)合靶點(diǎn)，并具有更大的臨床轉(zhuǎn)化前景。

基于AI的親和力優(yōu)化

二代測(cè)序（NGS）通過(guò)基于序列相似性和特征識(shí)別可能編碼高親和力抗體的核酸，增強(qiáng)了對(duì)高親和力抗體發(fā)現(xiàn)的能力，允許以前所未有的規(guī)模篩查編碼核酸的抗體。此外，人工智能和基于機(jī)器的學(xué)習(xí)（AI/ML）增強(qiáng)了NGS以更高的精度篩選更多高親和力結(jié)合序列的能力，并證明了其在抗體、基因聚類、從頭設(shè)計(jì)、優(yōu)化和調(diào)節(jié)結(jié)合親和力方面的能力。

通過(guò)抗體結(jié)構(gòu)工程化調(diào)節(jié)靶點(diǎn)結(jié)合

除了靶親和力之外，通過(guò)改造天然單特異性形式之外的結(jié)構(gòu)，可以增強(qiáng)抗體與靶的結(jié)合，包括在單個(gè)分子內(nèi)配對(duì)兩組不同的CDR以產(chǎn)生雙特異性抗體。此外，功能結(jié)構(gòu)域的引入導(dǎo)致了更復(fù)雜的形式的發(fā)展，如三特異性抗體和免疫細(xì)胞因子。

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三、測(cè)量抗體-抗原相互作用的方法

準(zhǔn)確測(cè)量抗體親和力，理解結(jié)合動(dòng)力學(xué)，可以有效指導(dǎo)藥物開(kāi)發(fā)。抗體 - 抗原互相作用的測(cè)定方法大致可以分成兩大類：一類是把其中一個(gè)分子（通常是抗原）固定在芯片或者板子上，然后測(cè)定另一個(gè)分子（抗體）的結(jié)合參數(shù)，比如 SPR 、 BLI 。另一類是直接在活細(xì)胞上做實(shí)驗(yàn)，看抗體怎么結(jié)合到細(xì)胞表面，比如流式細(xì)胞術(shù)、 KinExA 等等。

表面等離子共振（SPR）

SPR被廣泛用于實(shí)時(shí)測(cè)量抗體與固定抗原、補(bǔ)體或Fcγ受體的結(jié)合動(dòng)力學(xué)。這種高通量、無(wú)標(biāo)記的技術(shù)提供了對(duì)抗體-抗原結(jié)合動(dòng)力學(xué)的詳細(xì)分析，包括結(jié)合率和解離率。通過(guò)固定任一結(jié)合伴侶。結(jié)合和解離事件會(huì)改變固定分析物的金膜芯片的折射率，從而導(dǎo)致可以實(shí)時(shí)測(cè)量的光散射強(qiáng)度的變化。

然而，在將體外和體內(nèi)發(fā)現(xiàn)相關(guān)聯(lián)時(shí)，SPR可能缺乏生理相關(guān)性。固定化的細(xì)胞表面抗原可能無(wú)法在細(xì)胞膜內(nèi)準(zhǔn)確復(fù)制其三維結(jié)構(gòu)，溶液中的天然抗原相互作用受到固定化的限制，從而限制了觀察到的相互作用自由度。此外，SPR中使用的緩沖條件可能無(wú)法準(zhǔn)確反映pH、溫度或成分方面的生理結(jié)合環(huán)境。

流式細(xì)胞術(shù)

細(xì)胞計(jì)量學(xué)細(xì)胞結(jié)合試驗(yàn)用于針對(duì)固定數(shù)量的表達(dá)靶抗原的細(xì)胞進(jìn)行抗體滴定。這些檢測(cè)使用熒光標(biāo)記的配體或標(biāo)記的第二抗體來(lái)檢測(cè)結(jié)合，從而可以確定達(dá)到半數(shù)結(jié)合的濃度（EC50）和最大結(jié)合，這可以提供對(duì)抗體結(jié)合機(jī)制的見(jiàn)解。

設(shè)計(jì)細(xì)胞結(jié)合方法時(shí)有幾個(gè)考慮因素，包括配體耗竭和平衡。基于細(xì)胞術(shù)的檢測(cè)的其他局限性包括抗原：抗體復(fù)合物內(nèi)化，導(dǎo)致觀察到的抗體結(jié)合減少。

動(dòng)力學(xué)排斥試驗(yàn)

動(dòng)力學(xué)排斥試驗(yàn)（KinExA）是一種基于溶液的試驗(yàn)，用于確定免疫復(fù)合物的結(jié)合伴侶濃度和平衡解離常數(shù)。在抗體親和力測(cè)量中，靶抗原被恒定濃度的抗體結(jié)合位點(diǎn)，使其平衡，隨后在流動(dòng)中暴露于抗原包被的珠粒中。用熒光偶聯(lián)的二抗檢測(cè)珠捕獲的抗體，從而能夠在平衡時(shí)定量游離抗體并測(cè)定抗體親和力。由于這種測(cè)定通常可以達(dá)到平衡，因此被認(rèn)為更適合測(cè)量高親和力、亞納摩爾的相互作用。

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四、抗體親和力與功能的關(guān)系

抗體對(duì)其靶標(biāo)的親和力通常被認(rèn)為與其誘導(dǎo)藥理作用的能力密切相關(guān)。然而，這種相關(guān)性并不完全是線性的，并且高度依賴于所討論的特定藥理作用，以及它是否是由于靶細(xì)胞表面的靶占據(jù)或抗體密度引起的。

緊密結(jié)合及其對(duì)抗體功能的影響

高親和力抗體通常會(huì)與其靶抗原表現(xiàn)出“緊密結(jié)合”，其特征是當(dāng)抗體濃度遠(yuǎn)低于抗原濃度時(shí)，仍能有效結(jié)合，導(dǎo)致游離抗體被耗盡。通常抗體親和力與其藥理學(xué)效果密切相關(guān)，但親和力與功能的關(guān)系并非總是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，其取決于具體機(jī)制和效應(yīng)來(lái)源。

拮抗性抗體

拮抗性抗體通過(guò)直接受體結(jié)合或隔離激活配體來(lái)破壞受體信號(hào)傳導(dǎo)。可以通過(guò)觀察靶受體激活的下游效應(yīng)來(lái)評(píng)估它們的功能，包括從測(cè)量信號(hào)事件（如配體結(jié)合后不久的受體磷酸化）到對(duì)細(xì)胞增殖或表型的下游影響。通常靶標(biāo)親和力和效力之間呈線性關(guān)系，更高親和力的抗體能夠在較低濃度下引發(fā)它們的作用。此外，這里可能存在一些表位依賴性，因?yàn)榕c受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合的抗體比與更遠(yuǎn)端表位結(jié)合的抗體更有效。

免疫細(xì)胞接合器

參與抗體的免疫細(xì)胞涵蓋了廣泛的作用機(jī)制，所有這些機(jī)制都會(huì)誘導(dǎo)靶細(xì)胞的細(xì)胞毒性，例如通過(guò)ADCC、ADCP或CDC。除了這些傳統(tǒng)的Fc介導(dǎo)的效應(yīng)器功能外，還包括了T細(xì)胞和NK細(xì)胞結(jié)合器，通過(guò)Fab介導(dǎo)的靶向特定效應(yīng)細(xì)胞免疫受體來(lái)招募免疫細(xì)胞。

通常在這些復(fù)雜的作用機(jī)制中，親和力和功能之間的關(guān)系并沒(méi)有明確界定，其中抗體靶結(jié)合與補(bǔ)體或FcγR結(jié)合和/或免疫細(xì)胞結(jié)合是同時(shí)需要的。對(duì)于Fc依賴性細(xì)胞毒性機(jī)制，高親和力抗體可能導(dǎo)致雙價(jià)結(jié)合，占用兩個(gè)抗原但只提供一個(gè)Fc，降低效應(yīng)細(xì)胞募集效率。相比之下，親和力較低的抗體更有可能以單價(jià)結(jié)合，導(dǎo)致更大的細(xì)胞調(diào)理、Fc呈遞，從而導(dǎo)致免疫細(xì)胞和補(bǔ)體募集。

雙特異性T細(xì)胞和NK細(xì)胞接合器的功能活性受TAA和T/NK細(xì)胞靶向域親和力的調(diào)節(jié)。對(duì)TAA的親和力必須足夠高才能與靶標(biāo)結(jié)合，但必須仔細(xì)考慮對(duì)CD3的親和力，以平衡細(xì)胞毒性作用，同時(shí)降低與細(xì)胞因子釋放相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)。

激動(dòng)劑抗體

激動(dòng)劑抗體利用其二價(jià)性質(zhì)促進(jìn)其靶標(biāo)在靶細(xì)胞膜或溶液中的聚集。通過(guò)這種方式，它們可以模仿天然存在的配體，誘導(dǎo)受體激活或靶標(biāo)交聯(lián)。

抗體親和力和激動(dòng)活性之間的關(guān)系尚未像拮抗抗體那樣得到廣泛的研究。一項(xiàng)研究調(diào)查了靶向三種不同受體（PD-1、CD40和4-1BB）的激動(dòng)性抗體的親和力和功能關(guān)系，這些受體需要聚集才能引發(fā)其激動(dòng)活性。該研究表明親和力和功能之間存在鐘形關(guān)系，低親和力而非高親和力是由更快的解離速率驅(qū)動(dòng)的，導(dǎo)致最大的激動(dòng)作用。此外，還觀察到除親和力之外的抗體的其他特性會(huì)影響體外效力，包括鉸鏈靈活性和對(duì)Fab構(gòu)象的影響。

抗體偶聯(lián)藥物

ADC的結(jié)構(gòu)很復(fù)雜，其功效受到其物理化學(xué)性質(zhì)和生物學(xué)特征的影響，如細(xì)胞內(nèi)化、有效載荷釋放和有效載荷的作用機(jī)制。連接子-有效載荷與抗體的結(jié)合，無(wú)論是通過(guò)共價(jià)還是非共價(jià)修飾，都會(huì)改變ADC的物理化學(xué)特性。

一般來(lái)說(shuō)，高親和力可能提高細(xì)胞內(nèi)吞和載荷釋放效率，但也可能增加脫靶毒性。而低親和力可能減少脫靶結(jié)合，但也可能降低腫瘤細(xì)胞攝取效率。親和力的選擇需要平衡靶向性、內(nèi)吞、載荷釋放和安全性等各方面。

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結(jié)語(yǔ)

抗體結(jié)合定量技術(shù)的快速發(fā)展為精準(zhǔn)治療和藥物研發(fā)開(kāi)辟了新的可能性。通過(guò)對(duì)抗體親和力與功能性親和力的深入理解與優(yōu)化，結(jié)合AI技術(shù)、序列工程和功能域設(shè)計(jì)，我們不僅能夠提升抗體的治療效力和靶向性，還能顯著降低副作用風(fēng)險(xiǎn)。未來(lái)，隨著跨學(xué)科技術(shù)的融合與創(chuàng)新，抗體療法有望在癌癥、自身免疫疾病和感染性疾病等領(lǐng)域?qū)崿F(xiàn)更突破性的進(jìn)展，最終為患者提供更安全、更個(gè)性化的治療方案。這一領(lǐng)域的持續(xù)探索，將深刻影響生物醫(yī)藥的發(fā)展方向與臨床實(shí)踐。

參考資料：

1.Quantifying antibody binding: techniques and therapeutic implications. MAbs. 2025 Feb 16;17(1):2459795

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