類器官研究火到發燙，導師一句「跟上熱點」把我推上不歸路！現在別說頂刊夢，能不能按時畢業都成謎！

師姐，我收了半個月的腫瘤樣本，提的細胞養了一周才勉強成球，結果過夜就解體了。

師姐

大概率是細胞活力和接種密度沒把控好。類器官培養得挑活力 > 90% 的細胞，而且不同腫瘤細胞的成球密度差很多。

細胞密度我是按照你們筆記來的呀！

師姐

那是肝癌細胞的經驗！你養的乳腺癌細胞得重新優化參數。成球速度慢還可能和基質膠濃度、培養基添加物有關，我這里有一些類器官培養資料，發給你好好學習一下吧！（點此免費領取類器官資料包）

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資料包亮點搶先看

Part 1 類器官的培養方案

包埋培養與擴增：小細胞簇和/或腫瘤類器官形成后，將其收集并重鋪于基底基質提取物（BME，Geltrex Flex 基質膠）圓頂中，進行包埋培養下的初始擴增（通常傳代 2～4 次），直至獲得穩定的增殖速率；在建立新的腫瘤類器官系時，初始幾次傳代過程中活細胞數量常會出現下降。成功建系后，腫瘤類器官開始以相對穩定的倍增時間進行擴增，此時可過渡至懸浮培養以便于大規模擴增。包埋培養的更多細節請參閱相關實驗手冊。

懸浮培養擴增：一旦獲得穩定的細胞增殖，建議采用懸浮培養進行大規模擴增以建立細胞庫。在過渡至懸浮培養前，建議先凍存至少兩管取自包埋培養的細胞（每管 ≥ 2 × 10? 個活細胞），隨后將 ≥ 2.5 × 10? 個活細胞鋪板至懸浮培養體系（相當于 2.6 × 10? 個活細胞/cm2）。將包埋培養體系過渡至懸浮培養的更多細節請參閱實驗手冊。

從包埋培養到懸浮擴增，類器官的穩定增殖只是研究的第一步。想要真正解鎖其在腫瘤生物學和藥物篩選中的應用潛力，基因編輯和轉染技術的選擇尤為關鍵——錯誤的改造方法可能導致類器官異質性喪失，甚至完全偏離原始腫瘤特征。

Part 2 腫瘤類器官改造及轉染痛點全解析

將腫瘤類器官改造為過表達或下調特定基因，更好地了解癌癥生物學，或評估某些藥物對腫瘤細胞的作用。建議采用轉導方法以獲得穩定的細胞庫，可保留親代腫瘤類器官群體的遺傳和轉錄組學特征。不建議在通過電轉染或脂質體轉染遞送有效負荷后進行克隆選擇，因為克隆擴增和/或低轉染效率可能導致腫瘤類器官群體的異質性喪失，具體對比數據可見下表。

? 傳染常見痛點及解決方案

更多腫瘤類器官基因改造操作要點可在手冊中查看（點此免費領取類器官資料包）

Part 3 如何利用腫瘤類器官輕松完成藥物篩選

腫瘤類器官模型用于藥物篩選，常受限于培養基不好用、模型適用范圍窄、擴增難等問題。好在 Gibco? OncoPro? 腫瘤類器官培養基能針對性解決這些痛點，讓藥物篩選更輕松。下面以結直腸癌類器官為例，為大家介紹藥物篩選流程：

第 1 步：使用 OncoPro 腫瘤類器官培養基懸浮培養細胞，進行擴增。若要接種一個完整的 96 孔板，需要大約 1.5 X 106 個解離的腫瘤類器官。

第 2 步：在平底 96 孔板的每孔 100 μL 培養基中接種10,000～15,000 個解離的腫瘤類器官，以保持接種量一致，穩健形成腫瘤類器官。后續保持培養 72 h。

第 3 步：將化合物以 2X 濃度添加到 100 L 含有 BME 的 OncoPro 培養基中，至 96 孔板中每孔的最終體積為 200 L，每孔中的最終藥物濃度為 1X。所有篩選分析中均應包含適當的陽性和陰性對照。

第 4 步：在第 6 天添加 PrestoBlue HS 細胞活力試劑，并在第 7 天讀取信號，獲得結果。

更多藥物篩選方案及操作要點可在手冊中查看（點此免費領取類器官資料包）

新手剛接觸 3D 細胞培養，總擔心類器官太難 hold 住？別慌！可以先從入門級的球狀體培養入手。不用復雜設備，跟著手冊走，3 步就能建起 3D 腫瘤細胞模型～

Part 4 新手必看的 3D 腫瘤細胞模型構建速成攻略

第 1 步：選擇正確的培養基進行細胞系培養

3D 細胞培養所用的基本培養基與 2D 細胞培養中所用的相同。一般而言，基礎培養基通常會補充血清，并額外添加特定生長因子、細胞因子和激素。

第 2 步：使用 Nunclon 形成均勻的細胞球狀體

? 在細胞達到分裂融合度后，使用細胞解離試劑（如 TrypLE 試劑）將單層細胞從細胞培養表面剝離，制成單細胞懸液，并檢測細胞濃度和活性。根據細胞接種密度，在完全培養基中稀釋所需數量的細胞，然后接種到 Nunclon Sphera 超低附著培養板上。

? 離心后將培養板置于 37 °C，5% CO2 的培養箱中靜置培養。球狀體生長時，使用新鮮培養基更換原培養基，使原培養基與新鮮培養基的比例為 1:1，并以固定時間間隔置培養基換直到球狀體準備就緒。

第 3 步：針對具體細胞類型優化生長條件

? 有些細胞類型可以很容易地形成球狀體，而有些細胞類型的球狀體形成條件則非常苛刻。對于后者，需要對培養基或細胞接種條件進行一系列優化以促進球狀體形成。

? 通常，具有圓形形態并成簇生長的細胞易于形成球狀體。而長形且不成簇生長的細胞需要額外的培養基添加劑才能形成球狀體。

第 4 步：檢查球狀體大小、緊密度、細胞健康狀況和活性

使細胞在懸浮條件下生長以形成球狀體會讓它們承受較大壓力。因此，在將球狀體用于下游測定之前，評估細胞的健康狀況和活性非常重要。通常使用直徑 300～500 μm 的腫瘤細胞球進行藥物反應測定。借助成像和酶標儀評估細胞活性和健康狀況。

第 5 步：測量化療藥物的劑量反應

? 在完成對細胞健康狀況和球狀體活性的評估之后，即可將健康的球狀體用于各種下游測定。

? 包括但不限于：細胞毒性檢測、細胞凋亡檢測、細胞增殖經檢測，以及評價藥物治療對基因和蛋白質表達的影響的檢測。

具體實驗細節及注意事項可在手冊中獲取。

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內容策劃：王丹琦

內容審核：吳軍

題圖來源：圖蟲創意