作為生物相關(guān)專業(yè)的您，一定對各種克隆技術(shù)不陌生吧？分子克隆主要包括以下幾個(gè)環(huán)節(jié)：目的基因DNA的獲取、表達(dá)載體的選擇和準(zhǔn)備、酶切與連接、轉(zhuǎn)化與篩選、鑒定與測序等，體外實(shí)現(xiàn)目的基因在宿主細(xì)胞中的大量復(fù)制。

傳統(tǒng)的載體構(gòu)建離不開限制性內(nèi)切酶。在實(shí)驗(yàn)過程中，載體質(zhì)粒提取、酶切是否完全、連接是否成功、序列是否有突變等多種不確定因素都會(huì)限制陽性菌落的獲得。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程還耗時(shí)耗力，嚴(yán)重影響科研項(xiàng)目的進(jìn)度。

為了克服限制酶的局限性，克隆技術(shù)已經(jīng)衍生出多種無縫克隆技術(shù)。有一種神奇的實(shí)驗(yàn)操作，相信大家都聽說過吧？

不用酶切！不用連接！甚至“自信”到不用測序，一步操作把基因片段“滴”進(jìn)任意質(zhì)粒，25℃一小時(shí)即可完成反應(yīng)。最關(guān)鍵的是這一技術(shù)具有“一對多”的獨(dú)特本領(lǐng)，在構(gòu)建入門載體后，可根據(jù)自己的需要進(jìn)行多種表達(dá)載體的構(gòu)建，省去各表達(dá)載體之間的引物設(shè)計(jì)操作。

這就是Gateway克隆技術(shù)，一種基于λ噬菌體復(fù)制的分子克隆技術(shù)，由Invitrogen公司（現(xiàn)Thermo Fisher Scientific）開發(fā)。它利用λ噬菌體的附著位點(diǎn)（att位點(diǎn)）和重組酶系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)DNA片段的無縫克隆和轉(zhuǎn)移。

Gateway技術(shù)是限制性內(nèi)切酶克隆的高效替代方案，但是高昂的BP和LR酶價(jià)格，讓大部分人望而卻步。猶記得研究生期間，每次談到這一技術(shù)時(shí)，老板都會(huì)抱怨，幾百微升的酶卻要2W左右，用不起啊！

現(xiàn)在，義翹神州基于Gateway技術(shù)，在相關(guān)酶的制備工藝上獲得突破性進(jìn)展。ClickWay整合酶有望降到“親民”價(jià)格，讓你多了一種平替選擇。最最重要的是，我們市場調(diào)研的前期階段，為了測試酶產(chǎn)品的穩(wěn)定性，開放了一定數(shù)量的免費(fèi)試用名額，誠邀大家一起參與！

關(guān)注義翹神州公眾號，回復(fù)關(guān)鍵詞“整合酶”，申請免費(fèi)試用！

ClickWay一步法模塊化

ClickWay整合酶的原理與Gateway技術(shù)一樣，基于位點(diǎn)特異性重組。噬菌體在感染細(xì)菌時(shí)會(huì)發(fā)生整合與切割重組反應(yīng)。在酶的作用下，attP和attB位點(diǎn)間重組，噬菌體整合到細(xì)菌基因組上，并形成兩個(gè)新的重組位點(diǎn)（attL和attR）。在特定的環(huán)境下，attL和attR位點(diǎn)也能重組，導(dǎo)致噬菌體從細(xì)菌染色體上切除，重新產(chǎn)生attP和attB位點(diǎn)。在體外，ClickWay整合酶識(shí)別載體的att位點(diǎn)，將噬菌體與細(xì)菌整合的目的基因（GOI）插入到表達(dá)載體的序列中。

ClickWay整合酶原理示意圖（源自義翹神州講座課件）

BP反應(yīng)：構(gòu)建入門載體

在BP反應(yīng)中，ClickWay整合酶識(shí)別入門載體（Entry Vector）上的attP位點(diǎn)，以及GOI基因片段兩端的attB位點(diǎn)，從而發(fā)生催化反應(yīng)，使兩個(gè)位點(diǎn)之間發(fā)生定向重組反應(yīng)，形成含有目的基因且兩端為attL位點(diǎn)的入門載體。

ClickWay BP克隆試劑盒（貨號：SBBP01）包含噬菌體整合酶Int和大腸桿菌整合宿主因子IHF。前者是λ噬菌體將自身DNA整合到E.coli所必需的酶，介導(dǎo)attP和attB之間的重組反應(yīng)。后者在DNA重組和轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程中發(fā)揮作用，與Int協(xié)同作用，能夠發(fā)揮整合酶的催化功能。

BP克隆試劑盒使用簡單，可以將含有attB位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物整合到含有attP位點(diǎn)的通用供體載體上，如Donor Vector、Gateway?使用的pENTR-TOPO載體，獲得在目的基因兩端具有attL識(shí)別位點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)化入門載體。

入門載體構(gòu)建方案（源自義翹神州講座課件）

本試劑盒針對單片段和多片段克隆進(jìn)行專門設(shè)計(jì)優(yōu)化，經(jīng)高靈敏度核酸酶活性檢測試劑盒（Cat:NE001）確認(rèn)不存在核酸酶污染，實(shí)現(xiàn)了產(chǎn)品活性、魯棒性和穩(wěn)定性的顯著提升。BP克隆試劑盒可在-80℃條件下獨(dú)立保存12個(gè)月而活性不顯著降低，在-20℃穩(wěn)定保存至少6個(gè)月而依舊保持高活性。

LR反應(yīng)：快速穩(wěn)定重組

LR反應(yīng)是將入門質(zhì)粒中的目的基因轉(zhuǎn)移到表達(dá)載體的過程，具有方向性。LR反應(yīng)操作簡單，酶與DNA混合后在25℃孵育一小時(shí)即可完成反應(yīng)，真正的“一步法”，并且還可以在BP反應(yīng)管中直接加入LR整合酶，“一管到底”。LR反應(yīng)的切割與連接同步進(jìn)行，不會(huì)產(chǎn)生突變，結(jié)果“非必要”不測序。

同樣，LR試劑盒也非單一的酶，除了含有Int和IHF外，還有切除酶Xis。Xis能夠識(shí)別并結(jié)合在attL和attR位點(diǎn)附近的特定序列，與整合酶協(xié)同作用，促進(jìn)重組反應(yīng)進(jìn)行，使噬菌體DNA從大腸桿菌染色體上精確切除。ClickWay LR試劑盒（貨號：SBLR01）中，切除酶有助于高效充足，確保目的基因準(zhǔn)確的插入到表達(dá)載體中。

LR酶的作用原理（源自義翹神州講座課件）

ClickWay整合酶省時(shí)省力省錢，能夠?qū)崿F(xiàn)不同表達(dá)載體與報(bào)告載體間的基因重組。ClickWay最大的優(yōu)勢在于通用性強(qiáng)，入門質(zhì)粒可以與多種含不同功能元件的目的載體進(jìn)行LR反應(yīng)，構(gòu)建多種用途的表達(dá)載體，便于在不同宿主細(xì)胞中進(jìn)行基因表達(dá)，如大腸桿菌、酵母、哺乳動(dòng)物細(xì)胞等。

ClickWay無需考慮目的基因和載體上的酶切位點(diǎn)，節(jié)省設(shè)計(jì)引物、酶切、連接反應(yīng)的時(shí)間，在短時(shí)間內(nèi)完成多個(gè)基因的重組載體構(gòu)建。此外，ClickWay還可以與其他克隆技術(shù)結(jié)合試驗(yàn)，如Topo克隆

多基因整合反應(yīng)（源自義翹神州講座課件）

總之，ClickWay整合酶高效穩(wěn)定的特性，可以用于高通量載體構(gòu)建、CRISPR文庫、多基因共同表達(dá)載體構(gòu)建、多平臺(tái)系統(tǒng)平行轉(zhuǎn)化、融合蛋白構(gòu)建、功能基因組學(xué)、蛋白質(zhì)互作等“黃金”應(yīng)用場景。

義翹神州ClickWay整合酶操作簡單，無需PCR，25℃孵育一小時(shí)即可完成載體構(gòu)建。有望助你告別凌晨3點(diǎn)割膠純化的苦日子，讓你找到分子克隆真正的快樂。現(xiàn)在，趕緊行動(dòng)起來，申請領(lǐng)取免費(fèi)試用裝吧。

回復(fù)關(guān)鍵詞“整合酶”，申請ClickWay整合酶試用裝！

關(guān)于義翹神州

北京義翹神州科技股份有限公司（簡稱：義翹神州）是國內(nèi)蛋白、抗體研發(fā)生產(chǎn)專家，專注于為生命科學(xué)研究和創(chuàng)新藥物研發(fā)領(lǐng)域提供全面、高質(zhì)量的重組蛋白和抗體等生物試劑及專業(yè)、一站式的技術(shù)服務(wù)。公司總部位于北京，是國家高新技術(shù)企業(yè)，于2021年8月在深交所創(chuàng)業(yè)板上市，股票代碼：301047。

義翹神州擁有9,300余種重組蛋白、近15,000余種抗體、超50,000種基因及性能優(yōu)越的無血清培養(yǎng)基系列產(chǎn)品，建立蛋白表達(dá)、抗體開發(fā)與制備以及生物分析與檢測的一站式技術(shù)服務(wù)平臺(tái)。公司始終堅(jiān)持自主研發(fā)，現(xiàn)已成功研發(fā)出全長膜蛋白、激酶、磷酸化抗體等高難度試劑以及數(shù)款高質(zhì)量GMP級別細(xì)胞因子產(chǎn)品，具備每年自主開發(fā)2000種以上重組蛋白和抗體產(chǎn)品的技術(shù)能力，已建成全球規(guī)模領(lǐng)先的人源細(xì)胞表達(dá)重組蛋白生物試劑庫。