基于微流控技術(shù)的scRNA-seq, 僅能拍攝細胞快照，天花板明顯

萬乘基因百萬細胞級別scRNA-seq，可輕松快速獲取全畫幅高像素細胞表達譜

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超高通量單細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)（sci-RNA-seq3）是當(dāng)前生命科學(xué)領(lǐng)域的突破性技術(shù)，能夠高效解析樣本細胞組成，并在大規(guī)模單細胞水平上精確揭示基因結(jié)構(gòu)和表達動態(tài)。而傳統(tǒng)高通量轉(zhuǎn)錄組測序僅捕獲 1~2 萬細胞數(shù)，通量有限，往往只能檢出豐度較高的細胞類型。與傳統(tǒng)高通量轉(zhuǎn)錄組測序相比，萬乘基因研發(fā)團隊基于sci-RNA-seq3技術(shù)開發(fā)的商用10K超高通量scRNA-seq技術(shù)，具備百萬級細胞檢測能力，能全面解析組織復(fù)雜性，捕獲稀有細胞類型。與此同時，超高通量將實驗次數(shù)壓縮至極簡，造就了極低批次效應(yīng)，使其更接近“高保真定量標(biāo)準(zhǔn)”。該技術(shù)憑借其超高通量、高分辨率和卓越的兼容性，將在腫瘤學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、神經(jīng)科學(xué)及精準(zhǔn)醫(yī)療等領(lǐng)域發(fā)揮越來越重要的作用，推動生物醫(yī)學(xué)研究進入單細胞大數(shù)據(jù)時代。

一、產(chǎn)品技術(shù)原理

10K超高通量scRNA-seq技術(shù)的基本原理是基于分池條形碼編碼（split-pool indexing），通過多輪索引為每個細胞引入一個獨特的核酸組合標(biāo)簽，從而將海量起始細胞或細胞核的RNA同時進行條形碼標(biāo)記并建庫測序，以實現(xiàn)對大量單細胞的并行分析，從單個實驗中就能獲得百萬級別單細胞的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。

圖1. 10K超高通量scRNA-seq實驗原理圖

二、產(chǎn)品特點

超高細胞通量

超廣細胞類型檢出

更多基因覆蓋

超高性價比

三、產(chǎn)品應(yīng)用領(lǐng)域

• 腫瘤異質(zhì)性研究：讓每個癌細胞的“叛變計劃”無所遁形

• 發(fā)育生物學(xué)：胚胎分化的百萬選擇，高清“進度條”解析每個細胞的命運抉擇

• 神經(jīng)科學(xué)：神經(jīng)元類型的“人口普查”，解鎖罕見神經(jīng)元變異密碼

• 藥物研發(fā)：單次實驗百萬細胞通量，加速候選藥物“海選”賽

四、實測項目案例

利用萬乘10K超高通量snRNA-seq技術(shù)對6~8周齡成年小鼠的腦樣本進行檢測，共獲得約9萬個細胞核的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。作為對比，萬乘團隊選取了兩個公開數(shù)據(jù)集：

1）10x Genomics官網(wǎng)的小鼠腦細胞核snRNA-seq數(shù)據(jù)（Next GEM v3.1，數(shù)據(jù)集鏈接：https://www.10xgenomics.com/datasets/10k-Mouse-Brain-CNIK-3p-nextgem）；

2）Allen研究所發(fā)布的小鼠全腦組織單細胞公共數(shù)據(jù)集（10x平臺v3.1，數(shù)據(jù)集鏈接：https://alleninstitute.github.io/abc_atlas_access/descriptions/WMB-10Xv3.html）。該數(shù)據(jù)集具有細胞數(shù)量龐大，覆蓋鼠腦腦區(qū)范圍廣和注釋信息全面等優(yōu)勢。

1.基礎(chǔ)數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用萬乘10K超高通量snRNA-seq技術(shù)對小鼠腦樣本進行單細胞核測序，成功捕獲約8萬個細胞核的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。與10X Genomics鼠腦snRNA-seq相比，在相同測序深度下，萬乘10K超高通量snRNA-seq技術(shù)展現(xiàn)出顯著優(yōu)勢：

1）更高的轉(zhuǎn)錄本捕獲效率：單細胞中位UMI數(shù)、單細胞基因中位數(shù)及總物種基因覆蓋數(shù)均優(yōu)于10X平臺（表1.1）。

2）更優(yōu)的測序飽和度：10K超高通量測序的飽和度顯著低于10X平臺，表明該技術(shù)能夠更全面地捕獲細胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄本，提高低豐度基因的檢出率（表1.1）。

對比結(jié)果證明，萬乘10K超高通量snRNA-seq在單細胞核測序的通量、靈敏度和基因覆蓋度方面均優(yōu)于傳統(tǒng)10X平臺，更適用于大規(guī)模單細胞核轉(zhuǎn)錄組研究。

表1.1 數(shù)據(jù)統(tǒng)計和比較

備注：為便于平臺間橫向比較，將10X原始數(shù)據(jù)（平均55,780 read pairs /cell）下采樣至約17,817 read pairs /cell，與萬乘10K超高通量數(shù)據(jù)測序深度匹配。

2.聚類與注釋分析

單細胞RNA測序（scRNA-seq）是研究細胞異質(zhì)性的重要工具，但其應(yīng)用受限于對高質(zhì)量單細胞懸液的需求。對于腦組織、心臟、肌肉、脂肪等復(fù)雜組織或冷凍樣本，往往難以獲得足夠數(shù)量且高活力的單細胞。相比之下，單細胞核RNA測序（snRNA-seq）通過直接分離細胞核進行建庫，為這類難處理樣本提供了可靠的替代方案。這兩種方法各具特點：在樣本處理方面，細胞核提取通常能獲得更高的回收率。以小鼠腎臟組織為例，研究表明10毫克組織可提取1.5×106個細胞核 [1]，而相同質(zhì)量的組織經(jīng)酶解僅能獲得7.18×10?個完整細胞（萬乘基因內(nèi)部實驗數(shù)據(jù)）。在檢測效果方面，多項研究表明scRNA-seq和snRNA-seq在主要細胞類型的鑒定上具有良好的一致性 [2-3]。因此，方法的選擇應(yīng)綜合考慮組織特性和研究目的。

為評估萬乘10K超高通量snRNA-seq技術(shù)在細胞分群和注釋上的準(zhǔn)確性，萬乘團隊選取公開數(shù)據(jù)集2為參照。從該數(shù)據(jù)集中隨機選取約10,000個細胞，與鼠腦10K超高通量snRNA-seq數(shù)據(jù)進行比較分析。主要結(jié)論如下：

A）兩個平臺單細胞數(shù)據(jù)無系統(tǒng)性差異

10K與10x細胞整合聚類分析顯示（圖1.1），10K超高通量snRNA-seq數(shù)據(jù)能夠完整覆蓋10X scRNA-seq數(shù)據(jù)中的所有主要細胞類型，表明兩種方法在主要細胞類型的鑒定上具有高度一致性。這一發(fā)現(xiàn)與既往研究結(jié)果相符，進一步驗證了snRNA-seq技術(shù)即使在僅捕獲細胞核轉(zhuǎn)錄本的情況下，仍能準(zhǔn)確反映組織的細胞組成。

圖1.1 10K超高通量與10X高通量整合的UMAP聚類展示

B）二者在細胞大類層面結(jié)果高度一致

使用SCANPY工具，采用相同的注釋方法和標(biāo)準(zhǔn)對兩組數(shù)據(jù)（10K超高通量snRNA-seq和10X scRNA-seq）進行細胞類型注釋分析。結(jié)果顯示：

1）細胞類型數(shù)量和種類：10K超高通量數(shù)據(jù)成功注釋出31種細胞類型，10X數(shù)據(jù)注釋出30種細胞類型，缺失脈絡(luò)叢上皮細胞（choroid plexus epithelial cells）（圖1.2）。兩組數(shù)據(jù)在主要細胞類型的鑒定和數(shù)量上高度一致。

2）細胞類型占比：10K超高通量與10x數(shù)據(jù)在大多數(shù)細胞類型的比例分布基本一致，部分細胞類型在兩組數(shù)據(jù)中的占比存在取樣導(dǎo)致的細微差異（圖1.3）。

上述結(jié)果表明，在細胞大類層面，10K超高通量snRNA-seq與常規(guī)10X scRNA-seq具有相當(dāng)?shù)募毎⑨屇芰Γ以谀承┘毎愋偷臋z測上表現(xiàn)出更佳的靈敏度。

圖1.2 10K超高通量與10X高通量的主要細胞類型注釋聚類圖

圖1.3 10K超高通量與10X高通量的主要細胞類型比例分布

C）10K超高通量具有顯著的細胞亞類識別優(yōu)勢

利用相同的聚類方法對細胞亞類進行亞聚類。聚類分析結(jié)果顯示，10K超高通量平臺展現(xiàn)出顯著的細胞亞群鑒別優(yōu)勢。

1）聚類分辨率：10K超高通量數(shù)據(jù)獲得382個cluster，10X數(shù)據(jù)僅獲得164個cluster。在絕大多數(shù)主要細胞類型中，10K平臺檢測到的cluster數(shù)量顯著多于10X（圖1.4）。

2）稀有細胞檢測能力：10K平臺可穩(wěn)定檢測占比 < 0.1%的稀有cluster（如內(nèi)皮細胞亞型Arterial endothelial cells占比0.0696%，靜脈內(nèi)皮細胞亞型Venous endothelial cells占比0.0369%，二/三層腦內(nèi)神經(jīng)元亞型Layer 2/3 intratelencephalic neurons 占比0.0873%）。相同閾值下，10X平臺未能檢測到這些極低豐度細胞類型（圖1.5）。

上述對比充分證明，相較于傳統(tǒng)10X平臺，10K超高通量snRNA-seq具備以下突出優(yōu)勢：

1）顯著提升細胞亞型分辨能力；

2）突破性地提高稀有細胞檢出靈敏度；

3）為發(fā)現(xiàn)新型細胞亞群和稀有細胞群體提供了強有力的技術(shù)支撐。

圖1.4 10K超高通量與10X高通量的細胞大類對應(yīng)的亞類注釋數(shù)目統(tǒng)計

圖1.5 10K超高通量與10X高通量的細胞亞類占比分布

備注：Count（計數(shù)）：Y軸表示：每個 bin（區(qū)間）中包含的細胞類型數(shù)量。Percent（百分比）：Y軸表示：每個 bin 中的細胞類型數(shù)量占總數(shù)的百分比，所有柱子高度加起來為 100%。10X和10K各自分開計算。Density（密度）：Y軸表示：頻率密度，使得直方圖的面積和為 1。

進一步對小鼠腦皮質(zhì)投射神經(jīng)元1（cortical projection neurons 1）這一主要細胞類型進行了深入的亞群分析，結(jié)果顯示：10K超高通量平臺鑒定出42個顯著差異的cluster，10X平臺僅區(qū)分出15個cluster（圖1.6）。該結(jié)果進一步驗證了10K超高通量技術(shù)在神經(jīng)元亞型精細分群方面的卓越性能，能為神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的新型神經(jīng)元亞群發(fā)現(xiàn)和功能研究提供更強大的技術(shù)支撐。

進而對cortical projection neurons 1的cluster進行對比分析，10K超高通量snRNA-seq技術(shù)鑒定出許多特有的cluster，例如Layer 6 corticothalamic neurons，Layer 6 corticothalamic & subplate-like neurons，Layer 5 intratelencephalic neurons 和Layer 2/3 intratelencephalic neurons等（圖1.7）。這些cluster與腦的發(fā)育和功能有著緊密的關(guān)系。例如Layer 6 corticothalamic neurons（第6 層皮質(zhì)丘腦神經(jīng)元） 在大腦皮層與丘腦之間的信息傳遞中起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。常規(guī)高通量的scRNA-seq可能漏檢低豐度轉(zhuǎn)錄本（如神經(jīng)肽或受體基因），導(dǎo)致亞型關(guān)鍵標(biāo)記缺失和注釋難度。而10K超高通量snRNA-seq技術(shù)，鼠腦單樣本捕獲8萬多細胞核的轉(zhuǎn)錄本，極大地提升了分辨率，成功檢測和鑒定到此類cluster。Layer 6 corticothalamic & subplate-like neurons （第6 層皮質(zhì)丘腦及類似亞板神經(jīng)元）在丘腦-皮層環(huán)路中扮演關(guān)鍵角色，涉及感覺信息調(diào)控、皮層發(fā)育、神經(jīng)可塑性及節(jié)律生成。標(biāo)志基因非特異性，發(fā)育動態(tài)變化以及較低通量細胞的檢測成為其檢測和注釋的主要限制因素。10K超高通量細胞snRNA-seq信息在發(fā)現(xiàn)這類低豐度亞型和解析細胞狀態(tài)連續(xù)變化方面具有明顯優(yōu)勢，特別適合這類高度異質(zhì)的區(qū)域。

圖1.6 10K超高通量與10X高通量數(shù)據(jù)中cortical projection neuron 1細胞大類中亞類聚類圖

圖1.7 10K超高通量數(shù)據(jù)中cortical projection neuron 1細胞大類中特有亞類聚類圖

小結(jié)

本案例采用萬乘10K超高通量scRNA-seq平臺，單次實驗成功捕獲約8萬鼠腦細胞核的snRNA-seq數(shù)據(jù)。通過與10X微流控平臺的scRNA-seq數(shù)據(jù)對比分析，發(fā)現(xiàn)萬乘超高通量技術(shù)具有以下顯著優(yōu)勢：

技術(shù)性能方面：

單樣本即可實現(xiàn)超高細胞通量捕獲；

轉(zhuǎn)錄本檢測效率優(yōu)于10X平臺。

科學(xué)發(fā)現(xiàn)價值：

突破性地提高了稀有細胞類型的檢出能力；

可檢測到現(xiàn)有scRNA-seq技術(shù)難以覆蓋的極低豐度細胞亞群。

上述結(jié)果表明，萬乘10K超高通量scRNA-seq技術(shù)不僅在數(shù)據(jù)產(chǎn)出規(guī)模上實現(xiàn)了量級突破，更在稀有細胞檢測這一科研關(guān)鍵需求上展現(xiàn)出獨特的技術(shù)優(yōu)勢，為單細胞研究提供了更強大的工具。

五、應(yīng)用文章

洛克菲勒大學(xué)曹俊越課題組利用超高通量單細胞轉(zhuǎn)錄組技術(shù)（單細胞組合索引方法）對來自5個年齡段，共93只小鼠的13種器官，包括肺、心臟、肝臟、腎臟、肌肉、胃、十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸、棕色脂肪、腹股溝脂肪和生殖腺脂肪共623個組織樣本的逾2,000萬個細胞的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)進行了研究。研究覆蓋了從成年到老年的五個生命階段，并在每個階段嚴(yán)格保證性別均衡采樣。由于不同性別個體在衰老過程中呈現(xiàn)出顯著的分子和細胞差異，這種性別均衡的采樣設(shè)計對研究衰老機制至關(guān)重要，也確保了研究結(jié)果更具普遍性。研究獲得的全面的數(shù)據(jù)集揭示了200多種與衰老相關(guān)的細胞群，揭示了在生命進程中，組織、譜系和性別特異性的細胞動態(tài)變化，為深入理解衰老及相關(guān)疾病的分子機制、制定個性化的治療干預(yù)策略奠定理論基礎(chǔ)。

六、參考文獻

[1] Li H, Humphreys BD. Mouse kidney nuclear isolation and library preparation for single-cell combinatorial indexing RNA sequencing. STAR Protoc 3(4), 101904 (2022).

[2] Slyper, M., Porter, C.B.M., Ashenberg, O. et al. A single-cell and single-nucleus RNA-Seq toolbox for fresh and frozen human tumors. Nat Med 26, 792–802 (2020).

[3] Oh, JM., An, M., Son, DS. et al. Comparison of cell type distribution between single-cell and single-nucleus RNA sequencing: enrichment of adherent cell types in single-nucleus RNA sequencing. Exp Mol Med 54, 2128–2134 (2022).

七、擴展閱讀

目前超高通量scRNA-seq技術(shù)已經(jīng)成功應(yīng)用到發(fā)育，神經(jīng)類疾病，衰老，藥物研究等領(lǐng)域。部分參考文獻如下：

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