蛋白糖基化是一種重要的翻譯后修飾，其修飾的 蛋白 底物范圍和修飾位點 由糖基轉移酶與受體間的識別決定。酶催化的糖基化定點引入，是獲得均一糖蛋白的重要方法，尤其在N-糖基化研究中已成為有效手段之一。 細菌來源的糖基轉移酶 因其 易 于 表達純化等優良性質，常被改造為人工合成糖蛋白的工具酶 。然而 與N-糖基化不同，蛋白質O-糖基化通常缺乏嚴格、明確的識別序列， 且 O-連接糖基化修飾在原核生物與真核生物之間并不保守 ，細菌 O-糖基轉移酶 在糖基供體和底物識別范圍上與真核生物差距明顯，導致 通過 細菌糖基轉移酶 向 真核 蛋白位點 特異性引 入O-糖基化修飾 面臨挑戰。

2025年7月14日， 北京大學化學與分子工程學院、北大-清華生命科學聯合中心陳興/戴鵬團隊與北京大學 生命科學學院、 北大-清華生命科學聯合中心肖俊宇團隊合作，在Nature Chemical Biology雜志發表題為Protein β-O-glucosylation by Legionella LtpM via short consensus sequons G-T/S and S-G的研究論文，報道了嗜肺軍團菌效應蛋白LtpM作為β-O-葡萄糖基（β-O-Glc）轉移酶的性質和應用。該工作 鑒定了LtpM的修飾底物，闡明了其 通過 識別G-T/S、S-G序列向 許多 真核蛋白定點引入β-O-Glc修飾的機制。 通過LtpM這一定點引入O-糖基化修飾的有力工具，初步揭示了O-Glc替代O-GlcNAc修飾介導液-液相分離的潛力。

在開發 O-糖基轉移酶 的過程中，團隊將注意力聚焦在了病原菌效應蛋白上，部分效應蛋白具有糖基轉移酶活性，使用真核宿主細胞的糖供體并修真核蛋白底物。在前期發展的 α- O -Glc 糖基轉移酶SetA基礎上【1】，進一步開發了高效、位點特異性引入 β-O-Glc 修飾的新工具。 使用帶有 生物正交基團修飾的糖供體（尿苷二磷酸-6-疊氮-葡萄糖，UDP-6AzGlc） ，通過化學酶法策略結合串聯質譜 ， 鑒定了 嗜肺軍團菌效應蛋白LtpM 在細胞裂解液中的修飾底物（圖1）；在8 53 個底物蛋白上鑒定到1 176 個修飾位點，發現LtpM嚴格識別 G-T/S 、 S-G 序列。核磁共振表征證實LtpM催化形成的是 β-O-Glc 修飾。 通 過X射線晶體 結構研究 、分子模擬與生化 表征 ， 團隊探究 了 LtpM的催化機理和對蛋白底物的識別機制。 LtpM 糖基供體 結合口袋上方 存在 F166、Q167、W228和K225 四個氨基酸殘基 作為 門控位點（gate keepers ） ，形成 了 狹窄的底物蛋白 通道 ，從而嚴格限定 所修飾的 絲氨酸/蘇氨酸相鄰殘基必須為甘氨酸 這一側鏈最小的氨基酸 。

LtpM獨特的兩氨基酸識別序列（ G-T/S 、 S-G ）使其成為一 種 有力的糖基化研究 工具， 在包括天然N otch 蛋白在內的眾多靶蛋白底物上實現了位點特異性 β-O-Glc 標記。對于不符合該識別序列的目標修飾位點，可通過 插入或突變單個甘氨酸殘基實現 修飾，減少了引入長識別序列帶來潛在蛋白結構干擾 。基于對糖基供體底物修飾的容忍性，使用UDP-6AzGlc作為糖基供體， LtpM實現了 位點特異性 地 向 目標 蛋白質引入生物正交基團并進一步偶聯各種功能探針 ， 為生物偶聯提供了新方法。

圖1 . LtpM 嚴格識別G-T/S、S-G序列 實現 β-O- Glc修飾的 定點引入 。

考慮到 β- O-Glc修飾與 O-連接的β-N-乙酰氨基葡萄糖 （ β- O-GlcNAc）這一重要糖基化修飾的結構相似性，團隊提出O-Glc有望作為不被OGA水解的O-GlcNAc功能替代物（functional surrogate ）發揮作用這一科學假設，并使用LtpM定點引入O-Glc加以闡釋驗證。 SynGAP蛋白 T 1306 位的 O-GlcNAc修飾 通過阻斷其與PSD -95 蛋白的相互作用，抑制兩者液-液相分離過程【2】。通過LtpM高效地向SynGAP T1306位點特異性引入O-Glc修飾和相分離表征， 揭示了O-Glc替代O-GlcNAc介導液-液相分離的潛力。

綜上所述，這項研究實現了對軍團菌效應蛋白LtpM的底物鑒定、酶結構解析和催化識別機理研究，揭示了獨特的兩氨基酸識別序列。該工作為帶有β-O-Glc修飾糖蛋白的精準合成和該修飾的功能研究提供了高效的標記新工具。

陳興教授 、 戴鵬副研究員 、肖俊宇教授 為本文的 共同 通訊作者， 李威、高玲、崔世勇和 魏田田為共同第一作者。

https://www.nature.com/articles/s41589-025-01968-3

制版人： 十一

參考文獻

[ 1] Gao, L. et al. Legionella effector SetA as a general O-glucosyltransferase for eukaryotic proteins.Nat. Chem. Biol.15, 213–216 (2019).

[2] Lv, P. et al. O-GlcNAcylation modulates liquid–liquid phase separation of SynGAP/PSD-95.Nat. Chem.14, 831–840 (2022).

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