撰文丨易

CAR-T細(xì)胞療法在血液系統(tǒng)惡性腫瘤治療中取得了突破性進(jìn)展，特別是在B細(xì)胞白血病和淋巴瘤的治療中展現(xiàn)出令人矚目的臨床效果。然而，這一療法在實(shí)體瘤治療領(lǐng)域卻屢屢受挫，面臨著多重生物學(xué)屏障的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。首先，實(shí)體瘤特有的免疫抑制微環(huán)境會顯著削弱CAR-T細(xì)胞的活性，表現(xiàn)為免疫檢查點(diǎn)分子（如PD-1、CTLA-4）的過度表達(dá)和抑制性細(xì)胞因子（如TGF-β、IL-10）的富集。其次，實(shí)體瘤普遍存在的抗原異質(zhì)性導(dǎo)致靶抗原丟失或下調(diào)，使得CAR-T細(xì)胞難以持續(xù)識別和清除腫瘤細(xì)胞。此外，物理屏障（如致密基質(zhì)）和化學(xué)屏障（如缺氧、低pH）也嚴(yán)重限制了CAR-T細(xì)胞的浸潤和存活。

為突破這些限制， 研究人員 開發(fā)了 “ 裝甲型 ” CAR-T細(xì)胞，通過基因工程手段使其分泌免疫調(diào)節(jié)因子來重塑腫瘤微環(huán)境。IL-12因其強(qiáng)大的免疫激活能力成為首選，它能促進(jìn)T細(xì)胞和NK細(xì)胞的活化，增強(qiáng)抗原提呈，并抑制調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）的功能。然而，IL-12的全身性表達(dá)會引發(fā)嚴(yán)重的劑量限制性毒性，包括多器官炎癥反應(yīng)和致命的細(xì)胞因子風(fēng)暴。這一安全性問題在早期臨床試驗(yàn)（NCT01236573）中尤為突出，導(dǎo)致研究被迫終止。因此，開發(fā)能夠精確控制細(xì)胞因子表達(dá)時空特異性的技術(shù)平臺，成為推動裝甲型CAR-T臨床轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵突破口。

近日，澳大利亞彼得 ﹒ 麥卡勒姆癌癥中心Paul A. Beavis、Phillip K. Darcy、Amanda X. Y. Chen和Kah Min Yap聯(lián)合在Nature期刊上發(fā)表了文章Rewiring endogenous genes in CAR T cells for tumour-restricted payload delivery， 本研究開發(fā)了一種創(chuàng)新的CRISPR基因編輯策略，通過將治療性細(xì)胞因子（如IL-12）精準(zhǔn)插入CAR-T細(xì)胞的內(nèi)源性基因（NR4A2/RGS16）位點(diǎn)，利用這些基因的腫瘤微環(huán)境特異性啟動子實(shí)現(xiàn)細(xì)胞因子的精準(zhǔn)定位表達(dá)，在顯著增強(qiáng)抗腫瘤療效的同時避免了全身毒性，為實(shí)體瘤的CAR-T治療提供了突破性解決方案。

本研究創(chuàng)新性地提出了 “ 內(nèi)源性基因重編程 ” 策略，通過整合系統(tǒng)生物學(xué)分析和基因編輯技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了CAR-T細(xì)胞功能的全新優(yōu)化。 作者 首先采用多組學(xué)方法，通過對腫瘤浸潤C(jī)AR-T細(xì)胞和脾臟CAR-T細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq）進(jìn)行系統(tǒng)性比較，繪制了腫瘤微環(huán)境特異性基因表達(dá)譜。借助生物信息學(xué)分析，從數(shù)千個差異表達(dá)基因中篩選出27個候選基因，這些基因在腫瘤組織中呈現(xiàn)顯著高表達(dá)，而在外周組織中保持靜默狀態(tài)。其中，核受體NR4A2和G蛋白信號調(diào)節(jié)因子RGS16因其突出的腫瘤特異性表達(dá)模式脫穎而出。在技術(shù)層面， 作者 開發(fā)了一套高效的CRISPR-Cas9介導(dǎo)的同源定向修復(fù)系統(tǒng)。針對每個候選基因，設(shè)計(jì)包含同源臂的修復(fù)模板，將報(bào)告基因（GFP）或治療性細(xì)胞因子基因（如IL12、IL2）精準(zhǔn)插入目標(biāo)基因的翻譯起始位點(diǎn)下游。通過系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證， 研究 證實(shí)NR4A2和RGS16啟動子驅(qū)動的轉(zhuǎn)基因表達(dá)具有顯著的腫瘤組織特異性。

研究表明， 在多種實(shí)體瘤模型中，NR4A2/GFP CAR-T細(xì)胞在腫瘤部位的GFP陽性率高達(dá)80%，而在脾臟、肝臟等外周組織中陽性率不足2%，顯著優(yōu)于傳統(tǒng)NFAT啟動子系統(tǒng)（外周泄漏表達(dá)達(dá)10%）。這種嚴(yán)格的表達(dá)調(diào)控使得IL-12的局部遞送成為可能：在MC38結(jié)腸癌模型中，NR4A2/IL-12 CAR-T細(xì)胞不僅完全清除了已建立的腫瘤，還誘導(dǎo)了持久的免疫記憶 ， 并且 這些療效的取得完全沒有伴隨傳統(tǒng)IL-12療法常見的毒性反應(yīng)，治療組小鼠的體重、血清細(xì)胞因子水平和組織病理學(xué)檢查均與對照組無顯著差異。

單細(xì)胞RNA測序分析揭示了NR4A2/IL-12 CAR-T細(xì)胞的獨(dú)特活化特征。這些細(xì)胞表現(xiàn)出顯著的代謝重編程和效應(yīng)分子的高表達(dá)。 此外， 它們能夠重塑腫瘤免疫微環(huán)境：通過上調(diào)MHC分子增強(qiáng)腫瘤抗原提呈，促進(jìn)樹突狀細(xì)胞成熟，并招募內(nèi)源性CD8 + T細(xì)胞參與抗腫瘤反應(yīng)。TCR測序證實(shí)，治療后腫瘤內(nèi)出現(xiàn)了顯著的新抗原特異性T細(xì)胞克隆擴(kuò)增，表明成功誘導(dǎo)了表位擴(kuò)散效應(yīng)。

其次，作者 成功將該技術(shù)應(yīng)用于患者來源的CAR-T細(xì)胞。來自彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤患者的T細(xì)胞經(jīng)過NR4A2/IL-12編輯后，在體外展現(xiàn)出與健康供體細(xì)胞相當(dāng)?shù)臄U(kuò)增能力和腫瘤殺傷活性。重要的是，在低抗原密度（模擬臨床常見的抗原逃逸情況）條件下，這些細(xì)胞仍能維持有效的細(xì)胞因子分泌和腫瘤控制能力。 作者 還開發(fā)了 “ 一步法 ” 生產(chǎn)流程，通過單次電轉(zhuǎn)同時實(shí)現(xiàn)TRAC位點(diǎn)的CAR基因插入和NR4A2位點(diǎn)的細(xì)胞因子基因整合，大大簡化了臨床級CAR-T細(xì)胞的制備工藝。

綜上所述， 本研究開發(fā)了一種基于CRISPR的基因敲入策略，通過利用內(nèi)源基因的調(diào)控機(jī)制實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因的腫瘤局部特異性表達(dá)。通過篩選具有腫瘤限制性表達(dá)特征的內(nèi)源基因，發(fā)現(xiàn)NR4A2和RGS16啟動子能有效驅(qū)動IL-12和IL-2等細(xì)胞因子在腫瘤部位的靶向遞送，在同源移植和異種移植小鼠模型中均顯著增強(qiáng)抗腫瘤效果并提高長期生存率。該效應(yīng)伴隨著CAR-T細(xì)胞多功能性的提升、內(nèi)源性抗腫瘤免疫的激活以及良好的安全性特征，并且在患者來源的CAR-T細(xì)胞中同樣適用。

https://doi.org/10.1038/s41586-025-09212-7

制版人： 十一

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