撰文丨章臺柳

人類多能干細胞（ hPSCs ），包括人類胚胎干細胞（ hESCs ）和人類誘導多能干細胞（ hiPSCs ），能夠分化為多種細胞類型，如心肌細胞（ CMs ）、肝細胞（ HCs ）和各類心血管細胞，包括內皮細胞 （ECs） 、平滑肌細胞（ SMCs ）、周細胞 （PCs） 、成纖維細胞 （FBs） 、心內膜細胞（ ENDOs ）和心外膜細胞（ EPIs ）。人們已探索了多種在類器官中實現血管化的方法。例如，經典組織工程方法利用單獨分化的內皮細胞和基質細胞生成血管化的心臟和肝臟組織。轉錄因子 ETV2 、 GATA6 和 NGN1 的強制過表達已被用于在各種類型的類器官中誘導內皮細胞形成。立體光刻和三維（ 3D ）生物打印已被用于在肝臟和心臟細胞聚集體內生成血管網絡。 而 腎臟和腦類器官的新生血管化是通過體內植入實現的。盡管自組織方法已被成功用于創建血管類器官，但用這些方法生成的心臟和肝臟類器官均具有不同水平的內皮細胞、平滑肌細胞和周細胞；此外，由于這些研究的主要重點不在于此，因此這些細胞類型是否形成具有管腔的分支血管尚未得到探討。因此，將類器官的關鍵細胞類型與由強健分支、層級組織和管腔形成組成的新生血管一起分化尚未完全實現，這 是 類器官研究的一個主要瓶頸。 此外， 盡管模式生物已為器官血管化的最早階段提供了見解，但由于倫理限制和獲取早期發育階段胚胎的技術難度， 目前 對人類這一過程知之甚少。

2025 年 6 月 5 日 ， 來自 斯坦福大學 的 Joseph C. Wu 和 Oscar J. Abilez 團隊 在 Science 雜 志上發表文章

Gastruloids

enable modeling of the earliest stages of human cardiac and

hepatic vascularization

通過對人類多能干細胞（ hPSCs ）進行幾何微圖案化處理，可重復性且規模化地形成空間有序的胚層（內胚層、中胚層和外胚層），如類原腸胚、原條、心肌細胞和心臟類器官。在多孔板的每個孔中，使用單個經等離子體處理、帶有中心孔的橡膠模板， 可 以創建 2 毫米、 4 毫米或 6 毫米的圓形 hPSC 單層微圖案 。 相差顯微鏡和共聚焦熒光成像顯示，微圖案化的 hPSCs 具有多能性，其中 2 毫米的微圖案可最一致地形成完全匯合的細胞層，且心肌細胞與微圖案面積的比率最高。 為了使心臟類器官血管化，研究人員推斷 需要從 hPSCs 微圖案中誘導中胚層，從而產生中胚層來源的 CMs 、 ECs 和 SMCs 。為了使 內胚層來源的肝臟類器官血管化， 則 需要同時誘導內胚層以產生肝細胞（ HCs ），以及誘導中胚層以產生 ECs 和 SMCs 。 使用 hESC-RUES-GLR （胚層報告基因）細胞系 和 GSK3β 抑 制劑（ CHIR-99021 ， CHIR ） ，未圖案化的 hESC-RUES-GLR 在第 6 天時，在 不同 CHIR 濃度下會產生無序的胚層，但微圖案化組始終能生成有序的胚 層。在 4μM C HIR 誘導后，中央為 BRA + 中胚層區域，周圍環繞著 SOX17 + 內胚層環，而 SOX2 + 外胚層缺失。相比之下，未圖案化組在所有 CHIR 濃度下均以無序的方式表達 SOX2 。 使用 hESC-NKX2-5-eGFP 細胞系來觀察 微圖案化對心血管祖細胞形成的影響 ，微圖案分化 10 天后，會 形成有序的環形 NKX2-5-eGFP + 心血管祖細胞，進而產生搏動的心肌細胞 。 使用 hESC-TNNT2-GFP 熒光報告細胞系，我們證實 6 毫米的微圖案可以分化為心肌細胞 。 即 微圖案 化可產生有序的胚層、心血管祖細胞和心肌細胞，從而為篩選心血管類器官（cVO）形成的條件奠定了基礎。

為了進行 cVO 形成的各種分化條件的篩選，研究人員創建了一種 hESC 三重報告細胞系 （ hESC-TNNT2-GFP/CDH5-mOrange/TAGLN-CFP ）（ hESC-3R ），其包含 TNNT2 （肌鈣蛋白 -T ）啟動 子驅動的 GFP 以鑒定心肌細胞（ CMs ）， CDH5 （血管內皮鈣 黏 蛋白）啟動子驅動的 mOrange 以鑒定內皮細胞（ ECs ），以及 TAGLN （ SM22α ）啟動子驅動的青色熒光蛋白（ CFP ）以鑒定平滑肌細胞（ SMCs ） 。篩選出產生具有最多 CMs 、 ECs 和 SMCs 的 cVOs 的條件 ： 5μM CHIR （第 0 天）； 5ng/ml 成纖維細胞生長因子 2 （ FGF2 ）（第 0 、 7 、 9 、 11 、 13 、 15 天）； 5μM IWR-1 （ IWR ）（第 3 天）； 50ng/ml 血管內皮生長因子（ VEGF ）（第 5 、 7 、 9 、 11 、 13 、 15 天）； 10μM SB431542 （ SB ）（第 7 、 9 、 11 天）； 50ng/ml 血管生成素 -2 （ ANG2 ）（第 5 、 7 天）； 50ng/ml 血管生成素 -1 （ ANG1 ）（第 9 、 11 天）； 10ng/ml 血小板衍生生長因子 BB （ PDGF-BB ）（第 7 、 9 、 11 、 13 、 15 天）；以及 2ng/ml TGF-β1 （第 13 、 15 天）。 同時，研究人員利用延時成像、 RNA - seq 以及 scRNA - seq 對形成的 cVOs 進行空間和細胞組分的特征分析， 確定了 心血管類器官包含心肌、血管、心內膜、心外膜和神經細胞類型 ， 并觀察到 cVOs 中分支 ECs 緊密圍繞 CMs 和 SMCs ，并隨每個 CM 收縮同步運動 。使用最大強度投影（MIP）共聚焦成像等技術進一步觀察到cVOs包含與心房、心室、心內膜、心外膜和神經細胞空間整合的分支管腔化血管。

進一步對 cVOs 進行功能表征，發現 cVOs 的搏動顯著慢于對照組，而動作電位幅度沒有顯著差異，搏動速率 與體外培養的人類胎兒心臟組織（約 60 次 / 分鐘）和第 12 天 hPSC 衍生的心肌細胞（約 50 次 / 分鐘）的速率相似 。 cVOs 包含更多的心房樣心肌細胞和更少的心室樣心肌細胞。而且， cVOs 比對照組電活動、鈣瞬變和收縮持續時間更長 。使用 cVOs 探究影響血管和心臟發育的因素，發現 NOTCH 和 BMP 通路抑制會破壞血管系統，而阿片通路的激活會增加 cVOs 內的血管 。

最后，研究人員對 cVO 血管化策略是否能應用于肝臟系統進行探索。 使用 hESC -3 R 細胞系，在分化肝臟系統的基礎上添加血管化因子，最后對肝臟、膽管細胞和血管標記物進行終點免疫染色。在肝臟分化條件下，未產生“污染”的心肌細胞。使用 RNA - seq 、延時熒光顯微鏡、 MIP 共聚焦顯微鏡等技術對產生的 hVOs （肝臟 血管類器官 ）進行特征分析， 證實hVOs包含與多譜系肝臟細胞類型整合的、空間有序的分支管腔化血管網絡。

總的來說，研究提供了一種在體外研究新生器官血管化的先進技術，同時揭示出在不同器官系統內創建血管網絡涉及一個保守的發育程序。

https://www.science.org/doi/10.1126/science.adu9375

制版人： 十一

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