2025年7月15日，西湖大學生命科學學院Kiryl D. Piatkevich教授團隊在Nature Methods上發表題為“Genetically encoded biosensor for monitoring spatiotemporal dynamics of CCR2 ligands in culture and in vivo” 的研究論文。該研究通過基因工程手段，成功開發了一種基于趨化因子受體CCR2的基因編碼熒光探針——hCRAFi-CCR2，實現了對趨化因子CCL2在培養細胞和活體動物中時空動態變化的實時監測。這一技術為研究趨化因子在免疫調控、炎癥反應和疾病進展中的作用提供了全新的工具。

什么是趨化因子？為什么它很重要？

趨化因子是一類小分子蛋白質，它們在免疫系統中扮演“導航信號”的角色，引導免疫細胞（如單核細胞、巨噬細胞、T細胞等）遷移到身體需要它們的地方，比如炎癥部位、感染區域或腫瘤微環境。CCL2（也稱為單核細胞趨化蛋白-1，MCP-1）是其中一種關鍵的趨化因子，它通過與免疫細胞表面的CCR2受體結合，激活下游信號通路，從而調控免疫細胞的遷移和功能。CCL2在神經炎癥、創傷修復、腫瘤發展等多種生理和病理過程中都起著重要作用。

然而，長期以來，科學家們難以在活體中精確捕捉CCL2等趨化因子在體內細胞外空間釋放和分布的時空模式。傳統的檢測方法（如ELISA、Western Blot、質譜分析）雖然可以定量/半定量檢測趨化因子的總量，但無法提供實時、動態、高分辨率的空間信息。

hCRAFi-CCR2探針：一種“看得見”的趨化因子探針

為了突破這一技術瓶頸，研究團隊以CCL2的天然受體CCR2為骨架，通過基因工程技術，構建了一種可響應CCL2的基因編碼的熒光探針——hCRAFi-CCR2（Human Chemokine-Receptor Activation-based Fluorescent indicator-CCR2）。該探針的核心設計是在CCR2受體的第三個胞內環中插入一種環化重排的綠色熒光蛋白（cpGFP），并優化連接序列，使其在結合CCL2后能產生顯著的熒光變化。由于趨化因子價格昂貴，研究團隊首先建立自動化微量給藥和成像系統，該系統在提高篩選通量的同時，降低大規模篩選的成本。通過對三百多個突變體的篩選以及理性設計，最終得到一個具有良好的膜定位和高靈敏度響應特性的突變體，最大熒光變化可達300%以上。同時，研究人員還構建了一個無響應能力的突變體CRAFi-CCR2null作為陰性對照，確保信號變化的特異性。

圖1 | hCRAFi-CCR2熒光探針的構建與篩選

hCRAFi-CCR2探針的性能驗證

作為第一個趨化因子CCL2的熒光探針工具，研究人員對hCRAFi-CCR2探針在培養的不同類型的細胞中（HEK細胞、小鼠原代神經元和星形膠質細胞）進行了系統性驗證：

高度選擇性：探針僅對CCL2及其同源配體（如CCL2、 CCL7、CCL8等）有明顯響應，對其他趨化因子的反應極低，顯示出良好的特異性。

高親和力：在星形膠質細胞中，hCRAFi-CCR2對CCL2的親和力達到2.5 nM，是其他配體的19倍以上。

穩定性與安全性：探針在長時間暴露于CCL2后仍保持熒光穩定性，不會激活下游信號通路，也不會導致受體內化，確保了其在活體成像中的長期穩定性。

在體外細胞炎癥模型中實時監測CCL2釋放

為了驗證探針在炎癥研究中的應用潛力，研究人員在體外構建了星形膠質細胞炎癥模型。他們將hCRAFi-CCR2包裝進AAV病毒載體，并在小鼠星形膠質細胞中特異性表達。隨后，使用細菌脂多糖（LPS）模擬炎癥刺激，通過活細胞成像系統實時監測熒光變化。結果顯示，LPS處理2小時后，hCRAFi-CCR2的熒光信號逐漸增強，并與ELISA檢測結果高度一致，表明該探針能夠準確反映CCL2的釋放動態。此外，其他炎癥因子（如poly(I:C)、TNF-α）也能誘導探針信號上升，進一步驗證了其在炎癥研究中的廣泛適用性。

在活體小鼠模型中追蹤CCR2配體的動態釋放

研究團隊進一步將hCRAFi-CCR2探針表達于小鼠大腦皮層，并利用雙光子成像技術實時監測LPS誘導的系統性炎癥反應中CCR2配體（CCL2為主）的釋放。結果表明，在LPS注射后約5小時, hCRAFi-CCR2熒光探針信號的逐步增加。該信號在大腦皮層中呈現出明顯的空間異質性，形成多個“信號斑塊”（signal patches），并在不同炎癥階段表現出不同的信號強度和局部梯度。這種復雜的時空釋放模式為理解趨化因子在炎癥中的作用機制提供了全新視角。此外，在激光誘導的局部腦損傷模型中，研究人員也觀察到了探針熒光信號的顯著增強，進一步證明了該探針在活體成像中的實用性。

總之，這項研究首次實現了對趨化因子CCL2在細胞和活體中高時空分辨率的動態監測。hCRAFi-CCR2探針不僅具有高度選擇性和穩定性，而且適用于多種細胞類型和活體模型，為研究免疫調控、神經炎癥、腫瘤微環境等領域的關鍵問題提供了全新的工具。未來，研究團隊計劃進一步拓展該技術，開發針對其他趨化因子的熒光探針，推動趨化因子的系統性研究。

北京腦科學與類腦研究所井淼團隊為該研究提供了重要支持，他們的活體成像工作證實了該探針在活體成像領域的應用潛力。西湖大學生命科學學院副研究員肖弦為第一作者，北京腦科學與類腦研究所王晨雨和西湖大學郭遜為共同第二作者，通訊作者為西湖大學生命科學學院Kiryl D. Piatkevich教授。

為促進該技術的廣泛應用，研究團隊已將hCRAFi-CCR2相關質粒上傳至WeKwikGene和Addgene數據庫。論文中用到的質?？赏ㄟ^西湖實驗室的質粒平臺免費獲?。篽ttps://wekwikgene.wllsb.edu.cn/。

https://www.nature.com/articles/s41592-025-02742-y

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