傳統蛋白質設計多基于穩定的三維結構，我們習慣將蛋白功能與三維結構綁定在一起。但越來越多研究表明，約 40% 的人類蛋白質功能域為內在無序區域（ IDRs ）或內在無序蛋白（ IDPs ） —— 這些區域缺乏穩定結構、序列高度可變，使得它們成為藥物設計和功能解析中的 “ 黑洞 ” 。然而，它們廣泛參與：信號轉導、轉錄調控 ； 疾病蛋白聚集（如 tau 、 alpha-synuclein ） 以及 蛋白相互作用與蛋白降解 。 盡管自然界已進化出抗體、 MHC 分子、重復結構蛋白等多種機制識別特定蛋白無序序列， IDR 結構多樣未知、序列高度冗余，嚴重限制了抗體、小分子及經典蛋白設計方法的應用。因此長期以來被視為 “ 不可成藥 ” 的靶點區域。

2025年7月18日， Science 發表了來自 華盛頓大學蛋白設計研究所（ Institute for Protein Design ）所長David Baker團隊 的研究

Design of intrinsically disordered region binding proteins

核心設計流程 包括： 1 ） 構建模板蛋白庫：設計出約 1000 種蛋白骨架，這些骨架 “ 包裹 ” 住任意無序肽段的主鏈（其中肽段以非經典二級結構構象存在），并專門針對極性氨基酸構建出高保真度的氫鍵網絡和疏水識別口袋。 2 ） 拼接識別口袋：利用深度學習算法將不同識別口袋隨機組合成可以識別任意序列短肽的新蛋白架構（ 8-40 AA) 。該庫一旦生成，可供非專業設計人員重復回收使用。 3 ） 序列篩選與匹配：將待識別目標（如 full IDP 、短肽、 GPCR 尾段等）片段 “ 穿線 ” 進模板庫，打分尋找最優綁定構象和 靶向 窗口。 4 ） 局部構象調整及側鏈口袋優化：固定住由氫鍵網絡支撐起的肽鏈構象和核心作用位點 (motifs) ，采用 RFdiffusion 重組和優化所有剩余界面以進一步增強對每一靶標的側鏈識別特異性。通過迭代結構預測與優化 ( ProteinMPNN - AF2 iterations) 生成最終設計。 5 ） 結合實驗驗證：利用 BLI 、 nanoBiT 、 FP 測試，驗證設計蛋白對每一設計靶標的結合親和力和特異性（ 39/43 靶標一次獲得結合蛋白； 34/39 靶標未經優化 Kd < 100nM ；最低 Kd < 100pM ）。

團隊 成功設計出可結合 39 個高度不同目標的結合蛋白（包括疾病相關 IDRs 、 GPCR 配體、癌癥融合蛋白等），其中 34 個目標的設計未經任何優化體外 Kd 達到 pM 到 100 nM 級別。平均每個靶標實驗測試 22 個 設計。高極性序列也能被精準識別（如 EWS/FLI 、 CSP-N ），平均每 10 個氨基酸段內可形成 >10 個氫鍵（包含大量側鏈氫鍵用以提升序列特異性）。 團隊還 成功解析設計蛋白與目標肽段（如 dynorphin ）的晶體結構（ 3.15 ? ）與 NMR 譜，證實結合界面預測準確，且設計結合蛋白成功誘導無序靶標采用全新、自然界未知的構象結合（ “induced fit”) 。

該方法不僅具有普適識別能力，還直接展示了五類生物醫學和技術應用潛力：

1. 蛋白組富集低豐度復合物（ Enrichment & Interactome ）

可應用于探索功能未知的 IDR 復合體在信號通路中的作用，或富集超低豐度調控蛋白。

· 設計蛋白 FAM21_1b1 可從細胞裂解液中 結合 參與調控人體信號通路的整套 WASH 復合物（ WASHC1–5 ），顯示其能識別 IDR 驅動的蛋白互作網絡；

· 設計蛋白 PER2_1b1 可 釣出 調控晝夜節律的重要蛋白 PER2 ，證明其在相分離調控蛋白識別中的潛力。

2. 病變肽段富集（ Peptide Capture for Proteomics ）

為靶向變性蛋白片段、突變肽段檢測提供新工具，適用于疾病 早篩與蛋白質 組學富集。

· 設計蛋白 CTN4_1b1 針對一種 12aa 的突變肽段（來自新生兒溶酶體疾病相關蛋白 cystinosin ）；

· 用磁 珠結合 CTN4_1b1 后，與血液樣本孵育，僅用 LC-MS 即可檢測到極低濃度目標肽；

· 在緩沖液和血樣中回收率高達 90% ，優于之前發表的 高結合 力 α 螺旋結合蛋白在相似應用中的表現。

3. 癌細胞表面特異識別（ Targeted Cell Recognition ）

可作為新型腫瘤靶向工具，構建診斷 / 治療融合蛋白。

· Mesothelin （ MSLN ）是一種在多種癌癥中上調的膜蛋白。傳統抗體難以識別 其近膜區域 ， 而近膜無序 區域受人體蛋白酶剪切造成受體脫落，因而靶向失效；

· GFP-fusion 設計蛋白 MSLN_1b1 特異性結合表達 MSLN 的 HPAC 細胞，但不結合陰性 MCF7 細胞；

· 結合蛋白具有特異性定位未剪切癌細胞受體，或阻斷蛋白酶剪切的潛力。

4. 拮抗神經肽信號通路（ GPCR antagnosim ）

可延展至設計 GPCR 調控劑的新思路（通過結合多肽激動劑或 GPCR 胞外無序區間）。

· 神經肽 Dynorphin A 可激活 KOR （ kappa opioid receptor ），與慢性疼痛等病理有關；

· 設計蛋白 DYNA_2b2 在體外 cAMP 抑制實驗中，成功抑制 KOR 信號通路， IC?? = 50nM ；

· 該設計去除 YGGF 啟動子序列，具備良好特異性與調控能力。

5. 細胞內外靶向驗證與結合特異性測試（ In-Cell/in-vitro Orthogonality ）

為細胞內調控工具與模塊化合成元件設計提供可驗證機制。

· 將 6 種設計蛋白與 sfGFP 融合，靶標肽段與 mCherry 融合，定位于線粒體外膜；

· 所有 “on-target” 組合顯示 GFP 共定位，所有 “off-target” 組合無結合；

· 針對 20 個目標的全交叉體外 BLI 測定也驗證了綁定專一性（被測組均為 Kd < 100 nM ，極低交叉反應）。

這項研究突破了傳統蛋白質設計的結構限制，實現了對結構高度無序、功能復雜的蛋白區域的精準識別。相比天然抗體或現有識別蛋白，該平臺具備：高精度，高成功率設計：無需免疫動物或高通量篩選；適配性廣泛：普適性針對由易到難的各種疏水 / 親水 / 帶電序列；結構多樣性與適應性強：結合目標采用隨機卷曲、部分螺旋或部分 β 鏈 的多種靈活構象，對所有 20 種氨基酸普遍友好。

該技術為開發新一代識別、調控、降解內在無序蛋白提供了通用策略，具有廣泛的應用前景：疾病檢測與診斷（如癌癥融合蛋白、神經肽等） ； 細胞內信號調控與合成生物學工具 ； 神經退行性疾病的 早篩與治療 ； 全新藥物靶點開發（尤其是傳統 “ 不可成藥 ” 的蛋白區域） 。

原文鏈接：10.1126/science.adr8063

制版人： 十一

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