高尿酸血癥（HUA）是一種以血清尿酸濃度超過溶解度極限（生理pH值時血清尿酸水平＞6.8 mg/dL）為特征的代謝性疾病，黃嘌呤氧化酶（XOD）是嘌呤代謝中的關鍵酶，可將次黃嘌呤和黃嘌呤轉化為尿酸，是治療HUA的重要靶點。研發高效、低副作用的XOD天然抑制劑是目前治療HUA的研究熱點。

黑豆又被稱作烏豆，在我國的大豆資源中僅次于黃豆，位居第二。黑豆蛋白包含18種氨基酸，其組成與動物氨基酸十分類似，含量豐富且配比合理，對人體代謝調節等方面具有重要作用。大量研究已證實黑豆蛋白酶解物有較高的生物活性，如抗氧化性、血管緊張素轉換酶抑制活性、抗腫瘤、調節血糖血脂等。

黑龍江八一農墾大學食品學院的孫菁茹、王長遠*，國家雜糧工程技術研究中心的刁靜靜*等以黑豆蛋白為原料，以XOD抑制率、水解度（DH）為指標，篩選最佳酶解條件及參數；在此基礎上對黑豆酶解產物進行超濾分離獲得最優XOD抑制活性組分，并對其進行分子質量分布、氨基酸組成和穩定性分析，通過液相色譜-串聯質譜（LC-MS/MS）解析鑒定該組分黑豆XOD抑制肽的結構特征，以期為黑豆資源的合理利用及功能性食品的開發提供科學參考。

01

不同蛋白酶對黑豆蛋白酶解產物XOD抑制率的影響

由表2可知，在同一酶解時間，堿性蛋白酶解物的XOD抑制活性和DH顯著高于其他5 種酶解產物（P＜0.05），分別為73.61%和21.29%。這是由于蛋白酶的底物特異性會導致其作用位點的差異性，酶解后會得到不同分子質量及氨基酸序列的多肽片段。堿性蛋白酶酶切位點相對比較廣泛，可作用于疏水性或芳香族氨基酸的肽鍵，生成的小肽和氨基酸可能更易于與XOD的活性位點發生作用，從而增強其對XOD的抑制效果。因此，選取堿性蛋白酶為最適酶。

02

不同酶解參數對黑豆蛋白酶解產物XOD抑制率的影響

由圖1a所示，黑豆蛋白酶解產物的DH隨著酶解時間的延長而持續增加。當酶解時間＞4 h，DH變化速率降低，這說明在1～4 h，隨著酶解時間的延長，蛋白質持續被酶解，產生了大量蛋白殘基，當酶解時間＞4 h，酶解體系中蛋白質已逐漸被酶解完全，蛋白酶的作用位點趨于飽和，DH增加減緩。此時，黑豆蛋白酶解物的XOD抑制率隨著酶解時間的延長呈先上升后下降的趨勢，4 h時活性最強，這表明黑豆蛋白酶解物的XOD抑制率可能與黑豆蛋白酶解物的分子質量大小有關，適當水解，形成的肽段與XOD的結合能力可能更強，繼續水解后，分子質量進一步降低，可能會導致其與XOD的結合能力減弱，從而降低其活性。

圖1b是酶添加量對黑豆蛋白XOD抑制活性和DH的影響，隨著加酶量逐漸增加，DH一直呈上升趨勢，XOD抑制率呈先上升后下降的趨勢，酶添加量＜2%時，其XOD抑制活性均顯著高于2.5%和3%處理組。在加酶量為1.5%時，XOD抑制活性顯著高于其他處理組（P＜0.05），這進一步說明黑豆酶解產物XOD抑制活性與其分子質量緊密相關。在同一酶解時間下，不同酶添加量得到酶解產物的酶解速率不同，DH不同，其產物也不同，因此其結合XOD的能力也顯著不同。酶添加量過高，黑豆蛋白在同一酶解時間會被降解成分子質量更小的肽段殘基，使其XOD抑制能力降低，酶添加量低時，酶解速率低，酶解產物的得率較小，且從經濟方面考慮，對黑豆蛋白的利用率較低。

由圖1c可知，XOD抑制率隨著底物質量分數的增加呈先上升后下降的趨勢，當底物質量分數為3%時，XOD抑制活性最強，DH變化趨勢與其相同，說明酶和底物之間的結合強度與底物質量分數有關，當底物質量分數偏低時，足量的酶不能與底物充分接觸，產生的高活性肽段數量少；當底物質量分數過大會導致分子擴散受阻，流動性變差使酶解速率降低，最終導致XOD抑制率下降。綜上，最佳酶解參數為：酶解時間4 h、加酶量1.5%、底物質量分數3%。

03

黑豆蛋白酶解物超濾組分XOD抑制活性分析

由圖2可知，F3組分活性（IC50：8.76 mg/mL）相較于原酶解液（IC50：15.92 mg/mL），活性顯著提升。F2組分活性（IC50：25.8 mg/mL）雖高于F1組分（IC50：42.7 mg/mL），但明顯弱于酶解液。這表明，較高活性的黑豆XOD抑制肽主要存在于小分子肽段中。圖中陽性藥物別嘌呤醇（IC50：0.08 mg/mL）比F3組分具有更強的XOD抑制活性，可能是因為小分子質量的別嘌呤醇可以很好地嵌入XOD的活性口袋中。然而，肽作為比藥物別嘌呤醇更安全的物質，更適合長期治療。綜上，F3組分的黑豆蛋白酶解產物表現出顯著的XOD抑制效果。

04

穩定性分析

由圖3a可知，溫度≤90 ℃時，F3組分XOD抑制率差異不顯著（P＞0.05），當溫度≥90 ℃時，XOD抑制活性有略微下降趨勢，100 ℃時活性僅僅降低了約2%，推測這與高溫環境使活性多肽的結構發生局部變化有關，但其抑制率仍能達到原有活性的95.24%以上。結合表3結果，F3中肽分子質量大多小于1 500 Da，肽的分子質量與熱穩定性之間成反比，分子質量較大的肽易成簇堆疊，會阻止它們與酶的活性位點結合，小分子質量的肽在高溫下能更穩定地聚集，這可能是F3組分具有良好穩定性的原因。

圖3b是使用胃、腸階段體外消化模型來評價胃腸道消化對F3組分的XOD抑制活性的影響。體外模擬消化后酶解產物的生物活性是其在人體內生物利用度的良好指標。本研究中，經胃消化實驗，其XOD抑制活性與對照組相比提升了29.8%，進一步胰酶消化后，其活性雖有所降低，但仍高于對照組16%。這可能是因為肽的活性序列不會被消化酶降解，并且一部分活性肽可以抵抗胃腸道肽酶，特別是短鏈肽和含Pro的肽。胃蛋白酶主要作用于芳香族氨基酸或酸性氨基酸組成的肽鍵，這可能在C-端產生甲硫氨酸（M）、苯丙氨酸（F）或亮氨酸（L），以及在N-端產生酪氨酸（Y）、苯丙氨酸（F）或亮氨酸（L）。胰蛋白酶則特異性地切割位于精氨酸（R）或賴氨酸（K）組成的肽鍵。多肽經胃、胰蛋白酶進一步酶解，連接構象發生改變，從而暴露出原本被遮蔽的活性基團，這一過程可能會產生分子質量更小、具有更高XOD抑制活性的短肽[34]。綜上所述，F3組分表現出較高的熱穩定性和胃腸消化穩定性，有利于作為功能食品基料進行應用。

05

分子質量分布

從表3可知，F3分子質量＜1 500 Da的組分占88.34%，其中1 500～500 Da（31.88%）和500～180 Da（39.32%）為高占比組分，說明高XOD抑制活性肽段分子質量多集中于1 500～180 Da。而分子質量＞1 500 Da的組分占比較低，可能是因為肽的分子大部分呈線性結構，超濾過程中的濾膜附近自身的可變形范圍較大，同時壓力的驅動作用導致部分大分子質量的肽進入透過液，因此超濾膜實際有效截留分子質量大于理論截留分子質量。綜上，F3組分分子質量≤1 500 Da。

06

氨基酸組成分析

由表4可知，F3組分中必需氨基酸占總氨基酸的58.26%，和黑豆蛋白相比增加了16.33%，且明顯高于世界衛生組織與聯合國糧食及農業組織倡議的參考蛋白模式中約40%的必需氨基酸值，其占比越高，黑豆蛋白的營養價值越高。F3組分中的疏水氨基酸相對含量（56.66%）和堿性氨基酸相對含量（20.16%）也均高于黑豆蛋白。實驗結果表明，F3組分展現出較強的XOD抑制活性，含量豐富的疏水性氨基酸和堿性氨基酸可能發揮了關鍵作用。

07

F3組分的肽序列結果

為了深入了解黑豆XOD抑制肽的氨基酸序列和分子質量等信息，探索XOD抑制能力與其之間的相互關系，對F3組分采用LC-MS/MS進行序列測定，經數據庫搜索和比對，肽段序列解析，共檢測出18 種肽序列，如圖4所示。表5和圖5為肽序列含量排在前8位的肽序列及其相關信息，可以看出F3組分中主要肽段的分子質量范圍集中在500～1 400 Da，均＜1 500 Da，這與表3相對分子質量檢測結果一致，該組分肽段均是含有5～12 個氨基酸分子的短肽鏈。通過對現已報道的XOD抑制肽序列分析，發現XOD抑制肽活性的高低不僅與疏水性氨基酸、芳香族氨基酸及其殘基含量有關，也受堿性氨基酸的影響[40]。F3組分所測肽段中疏水性氨基酸、芳香族氨基酸和堿性氨基酸的相對含量分別為18.24%、6.92%和13.21%，鑒于芳香族氨基酸的相對含量較低，可以推斷在抑制XOD活性方面，疏水性氨基酸與堿性氨基酸可能發揮了更為顯著的作用。表5肽序列中N-端和C-端的疏水性氨基酸占比高達44.86%和33.14%，堿性氨基酸占比高達33.57%和39.29%，且肽序列N-端Lys、Arg、Leu 3 種氨基酸含量最高。肽序列C-端Lys、Val、Phe、Arg 4 種含量最高，均為疏水氨基酸或堿性氨基酸，其中Lys的占比最高，肽序列含量第一的肽段為Lys-Glu-Gly-Gly-Val-Leu-Pro-Gly-Ile-Lys（圖5a），推測黑豆XOD抑制肽起到關鍵降尿酸作用的可能是堿性氨基酸，具體的作用機制還有待進一步研究。

結論

本研究以黑豆蛋白為原料，以XOD抑制率和DH指標優化出黑豆XOD抑制肽最優工藝參數：堿性蛋白酶加酶量1.5%、酶解時間4 h、酶解溫度50 ℃、pH 9.0、底物質量分數3%，此條件下獲得的XOD抑制率和DH分別為73.61%和21.29%。在此基礎上，黑豆酶解物經超濾分離和XOD抑制能力分析得出，小分子肽在XOD抑制活性中起關鍵作用，XOD抑制活性最高組分F3（IC50：8.76 mg/mL），其分子質量≤1 500 Da，該組分含有高比例的疏水性氨基酸和堿性氨基酸，LC-MS/MS結果顯示，黑豆XOD抑制肽N-、C-端多以疏水性氨基酸和堿性氨基酸為主。活性穩定性結果發現F3組分還具有良好的熱穩定性和體外消化穩定性。本研究結果可為黑豆蛋白資源的開發利用提供新思路，為XOD肽類抑制劑的研究提供一定的理論參考。

作者簡介

通信作者：

王長遠 ， 黑龍江八一農墾大學副校長。

研究方向：

雜糧活性組分與營養及植物蛋白工程

教育經歷：

1996/9-2000/6，黑龍江八一農墾大學動科院 動物醫學學士；

2005/9-2008/6，黑龍江八一農墾大學動科院 預防獸醫學碩士；

2011/9-2015/6，東北農業大學食品學院 糧食油脂及植物蛋白工程博士。

工作經歷：

2000.07-2005.08，黑龍江八一農墾大學動物科技學院 團總支書記/講師；

2005.09-2008.12，黑龍江八一農墾大學食品學院 講師；

2009.01-2012.12，黑龍江八一農墾大學食品學院 黨委副書記/副教授/碩導；

2013.01-2015.08，黑龍江八一農墾大學食品學院 黨委書記/副教授/碩導；

2014.09-2014.11，國家教育行政學院學習；

2015.09-2016.01，黑龍江省委巡視組 掛職正處級巡視員；

2015.09-2018.02，黑龍江八一農墾大學食品學院 黨委書記/教授/博導；

2018.03-2024.01，黑龍江八一農墾大學食品學院 院長/教授/博士導；

2024.01-至今，黑龍江八一農墾大學 副校長/教授/博士導。

主要學術及社會兼職：

黑龍江省高層次人才（C類）、黑龍江省級領軍人才梯隊后備帶頭人（糧食、油脂與植物蛋白工程）、黑龍江省“頭雁團隊”骨干成員（雜糧綠色生產與精深加工）、黑龍江省食品與生物技術創新研究中心（省級國際科技合作平臺）負責人，兼任中國食品科學技術學會預制菜專業委員會委員、黑龍江省食品科學技術學會副理事長（兼任省食品科學技術學會黨支部書記），黑龍江省天然產物學會副理事長，黑龍江省糧油學會副理事長。

刁靜靜，國家雜糧工程技術研究中心研究員。

研究方向：

農產品加工及蛋白質綜合利用

教育經歷：

2001.09-2005.07，東北農業大學食品學院，食品科學與工程 工學學士；

2005.09-2008.07，東北農業大學食品學院，農產品加工與貯藏 工學碩士；

2013.09-2019.07，黑龍江八一農墾大學動物科技學院，基礎獸醫學 農學博士。

工作經歷：

2008.07-2010.08，八一農大省農產品加工工程技術研究中心 研究實習員；

2010.09-2015.08，八一農大國家雜糧工程技術研究中心 助理研究員；

2015.09-2022.08，八一農大國家雜糧工程技術研究中心 副研究員；

2022.09-至今，國家雜糧工程技術研究中心 研究員。

主要學術及社會兼職：

黑龍江省食品科學技術學會青年委員會委員；黑龍江省肉類協會理事。

第一作者：

孫菁茹， 黑龍江八一農墾大學食品學院， 碩士研究生。

研究方向：

食品科學

獲得榮譽：

2023年度 研究生二等學業獎學金 黑龍江八一農墾大學；

2023年度 研究生三好學生 黑龍江八一農墾大學；

2023年度 優秀學生骨干 黑龍江八一農墾大學；

2023年度 優秀共產黨員 黑龍江八一農墾大學；

科研成果：

研究生創新科研項目立項：黑豆黃嘌呤氧化酶抑制肽的制備及其體外降尿酸活性研究

學術交流：

2023年糧食安全與食品科技創新國際論壇 摘要收錄

2023年第五屆阿斯圖中俄創新食品科學與裝備會議 摘要收錄

2024年中國糧油學會第五屆糧新青年論壇 學術報告

本文《黑豆黃嘌呤氧化酶抑制肽的制備及體外降尿酸活性》來源于《食品科學》2024年45卷第23期72-80頁，作者：孫菁茹，孫銘爽，呂文慶，曹榮安，刁靜靜，王長遠。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20240509-052。點擊下方閱讀原文即可查看文章相關信息。

實習編輯：南伊；責任編輯：張睿梅。點擊下方閱讀原文即可查看全文。圖片來源于文章原文及攝圖網

為深入探討未來食品在大食物觀框架下的創新發展機遇與挑戰，促進產學研用各界的交流合作，由北京食品科學研究院、中國肉類食品綜合研究中心、國家市場監督管理總局技術創新中心（動物替代蛋白）及中國食品雜志社《食品科學》雜志、《Food Science and Human Wellness》雜志、《Journal of Future Foods》雜志主辦，西華大學食品與生物工程學院、四川旅游學院烹飪與食品科學工程學院、四川輕化工大學生物工程學院、成都大學食品與生物工程學院、成都醫學院檢驗醫學院、四川省農業科學院農產品加工研究所、中國農業科學院都市農業研究所、四川大學農產品加工研究院、西昌學院農業科學學院、宿州學院生物與食品工程學院、大連民族大學生命科學學院、北京聯合大學保健食品功能檢測中心共同主辦的“第二屆大食物觀·未來食品科技創新國際研討會”即將于2025年5月24-25日在中國 四川 成都召開。

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