外泌體

簡介

外泌體可以說是最近有點“炙手可熱”的新型藥物遞送形式。

這些源于細胞的天然囊泡具有生物相容性、低免疫原性，且可以有穿越血腦屏障（BBB）和致密腫瘤基質等生理屏障的巨大潛力。

胞外囊泡據大小分為三種亞型：外泌體（30-150 nm）、微泡（100-1000 nm）和凋亡小體（500-2000 nm）。

外泌體是直徑為30-150nm的異質性膜結合納米顆粒，與人工合成的LNP顆粒相比，外泌體非人造結構，不攜帶人工蛋白或胞外蛋白。

天然外泌體的內含物成分多種多樣，這些成分的組成可以說是對其來源細胞生理狀態的反應。

這些內含物包括蛋白質、miRNA、lncRNA、脂質和膜標志物（CD9、CD63、CD81），膜標志物已經用作外泌體的標志物。

外泌體蛋白質組學分析發現，外泌體中存在數千種蛋白，包括細胞骨架蛋白、膜轉運調節因子和代謝途徑的酶。

外泌體RNA組成也是異質性的，包括mRNA、microRNA（miRNA） 和長鏈非編碼RNA（lncRNA）。外泌體miRNA，在細胞間基因調控中發揮作用，lncRNA參與從免疫反應到癌癥轉移的許多生物過程。

脂質是維持外泌體結構和功能的成分，脂質的不同可以進一步區分外泌體的亞型。

外泌體

藥物遞送

既然天然的外泌體內涵多種分子成分，那可以人為的改變其內涵物，使其成為藥物載體。

目前已經開發出的外泌體藥物裝在策略分為被動裝載和主動裝載。不同方法對包封效率、穩定性和完整性的影響各不同。

被動加載：

被動加載是讓藥物分子自動擴散到外泌體內，無需使用外力。

最簡單的方法是把藥物與外泌體共孵育，這個過程適用于親脂性藥物，如紫杉醇，使用被動孵育48小時后保留率為78%。

通過凍融循環也可以擾亂外泌體膜的完整性，進而促進藥物進入外泌體，但是反復凍融會破壞和損害外泌體的完成性。

使用表面活性劑（如皂苷）也可以瞬時透化外泌體的膜，促進藥物滲透。然而，表面活性劑會影響外泌體功能，對臨床使用帶來了限制。

主動加載：

主動加載方法是利用外力來促進藥物進入外泌體中，這種方法對于親水性和大分子藥物非常有效。

使用電穿孔可以短暫的、有條件地破壞外泌體膜的穩定性，從而增加 siRNA和CRISPR-Cas9等核酸的內化，這樣可以促進核酸類的藥物進入外泌體。這種辦法的壞處是電穿孔可以誘導外泌體聚集，降低藥物的穩定性。

超聲處理利用超聲波引起外泌體膜的擾動，從而趁機使得藥物擴散到外泌體中。

轉染的辦法是將核酸遞送到外泌體分泌細胞中，從而在外泌體形成的過程，把治療的基因藥物包裝到囊泡上。

外泌體

工程化

通過對外泌體膜進行人工修飾，可以使其靶向特定組織，增強藥物在疾病區域的聚集，減少脫靶，提高了療效和特異性。

另外，工程化的改造大大增強了外泌體的穩定性、載藥能力和控釋行為。

將外泌體膜整合到LNP中，將外泌體的靶向能力和生物相容性與脂質體的載藥效率和膜流動性相結合。雜交囊泡更穩定，半衰期更長，藥物包封率更高。

把人工聚合物材料添加到外泌體中，經過工程改造，可提高藥物穩定性

聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）等pH敏感聚合物已被嫁接到外泌體上，以增加半衰期并支持在腫瘤部位的受控釋放。

此外，具有空心金納米顆粒（HGN）的雜交外泌體已被設計在診斷學中應用。雜交體很容易被癌細胞內化，同時用于成像和治療 。

外泌體

的質控

既然作為藥物使用，那必須有科學和嚴格的質控策略。質控參數包括，外泌體的大小、純度和載藥量，而功能測試評估它們在相關疾病模型中的生物活性等。

外泌體的大小分布是成功分離和區分的重要參數。納米粒子跟蹤分析 （NTA）和動態光散射（DLS）是常用的手段。

純度測試常用的辦法是Western Blot、HPLC等。

通常采用蛋白質印跡分析來確認外泌體標志物CD63、CD81和TSG101。

外泌體內部載藥的定量使用qPCR和HPLC。定量 PCR （qPCR） 已被用于檢查外泌體中的 miRNA 和 mRNA 組成。HPLC 用于外泌體中的蛋白質定量。

功能（Potency）的測定和表征需使用模型來開展。比如血腦屏障的外泌體功能驗證模型、外泌體滲透腫瘤組織的模型等。

外泌體

“擊穿”血腦屏障

受體介導的轉胞吞作用（RMT）廣泛存在于腦內皮細胞上的某些受體（如TfR、低密度脂蛋白受體（LDLR）和胰島素受體（INSR））。

利用這些受體通路，可以設計增強外泌體穿透血腦屏障（BBB）。

特異性靶向配體可以摻入到外泌體，如狂犬病病毒糖蛋白（RVG）肽和TfR配體。RVG肽與煙堿乙酰膽堿受體結合，通過外泌體遞送的藥物被遞送到神經元細胞。TfR配體通過受體介導的轉胞吞作用穿過BBB。

另外，可穿透腦的雙功能 IgG 融合蛋白提供了一種通過 BBB 遞送大分子生物治療藥物的途徑。利用靶向INSR或TfR等受體的單抗來介導受體介導的轉胞吞作用，可以穿透血腦屏障。

另外的遞送策略是“ 特洛伊木馬策略”，利用免疫細胞（如單核細胞）進入大腦的天然能力，使用其作為載體，把外泌體帶到BBB內。

除了改造外泌體外，通過新型的遞送方式，也是穿透血腦屏障的解決思路之一。

傳統給藥方式，如靜脈和口服，在穿越BBB方面不起作用，其他給藥方式，如鼻內和鞘內給藥，允許外泌體治療直接遞送到CNS系統。

鼻內給藥使用嗅覺和三叉神經通路，允許直接給藥到藥物的大腦。鞘內給藥將治療藥物直接引入腦脊液來完全規避 BBB。

不過新型的遞送方式也有一定的確定。鼻內給藥無創，可重復，但易受粘膜纖毛清除和酶分解的影響。鞘內注射在感染和并發癥方面可能存在風險。

外泌體

突破腫瘤屏障

使用靶向配體（如HER2抗體、葉酸受體和整合素αvβ3結合肽）進行修飾。如，靶向HER2的外泌體被設計為選擇性地將化療藥物和小干擾 RNA （siRNA） 遞送到 HER2 陽性乳腺癌細胞。

外泌體過表達CXCR4，缺氧腫瘤微環境大量表達 CXCL12 （SDF-1），這是 CXCR4 的趨化因子配體，因此可以趨化外泌體進入腫瘤微環境。CXCR4 工程化的外泌體不僅增強腫瘤靶向性，還參與重塑腫瘤微環境。

與正常組織（pH 7.4）比，腫瘤微環境更酸（pH 6.2–6.8），主要因為代謝率增加。利用pH差異，可設計pH敏感外泌體，介導藥物在腫瘤中釋放。

基質金屬蛋白酶MMP-2和MMP-9在腫瘤微環境中過表達，利用這些酶從外泌體釋放藥物也可增加外泌體的腫瘤特異性。

多藥耐藥 （MDR） 是癌癥治療中最大的障礙之一，基于外泌體通過共同遞送化療藥物和siRNA或使用CRISPR-Cas9 技術敲低耐藥基因來克服可以克服MDR。

外泌體還能夠作為免疫治療劑（包括檢查點抑制劑和抗原疫苗）的有效遞送載體，以刺激抗腫瘤免疫反應。

外泌體

作為藥物的挑戰

外泌體遞送藥物的最大缺點之一是它們會被單核吞噬細胞系統快速吸收，尤其是被肝 Kupffer 細胞吸收。

利用PEG化對外泌體進行表面改造，是用于延長循環時間和最大限度減少早期肝臟攝取的更常用方法之一。

然而，重復注射聚乙二醇化外泌體會引發加速血液清除 （ABC） 現象，從而形成抗 PEG IgM 抗體并迅速消除隨后的劑量。

人源外泌體具有生物相容性，但具有免疫原性，需尋找植物源性外泌體等替代來源。

質量穩定的外泌體的大規模生產仍然是一個主要瓶頸。外泌體具有高度異質性，藥物組成根據其細胞來源和培養條件而變化。

在監管方面，基于外泌體的療法分類很復雜。FDA傾向于將外泌體產品歸類為生物制劑，而EMA將其歸類為先進療法中的醫藥產品。

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