乳酸菌是一類利用碳水化合物發酵并產生大量乳酸的革蘭氏陽性細菌，主要有嗜酸乳酪桿菌（Lacticaseibacillus acidophilus）、干酪乳酪桿菌（L. casei）、副干酪乳酪桿菌（L. paracasei）和鼠李糖乳酪桿菌（L. rhamnosus）等。乳酸菌因具有良好的發酵特性且能夠在人體內發揮維持腸道屏障、提高免疫力等重要功能，而被廣泛應用于食品工業中。副干酪乳酪桿菌K56是內蒙古伊利實業集團股份有限公司分離自兒童腸道且目前已被廣泛應用的安全性發酵商業菌株，相關研究報道了副干酪乳酪桿菌K56具有調節腸道菌群、緩解肥胖和相關代謝紊亂疾病的功效。乳酸菌能夠對宿主腸道產生生理作用的重要前提是能有效黏附于腸上皮細胞，這種黏附作用可分為非特異性黏附和特異性黏附。

南京師范大學食品與制藥工程學院的吳梵、馬國文、郭宇星*等以副干酪乳酪桿菌K56為目標菌株，首先通過研究其在胃腸道環境中的耐受性、疏水性和自聚性等益生性能，闡釋其在腸道內發揮益生功能的具體作用機制；其次通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離純化、液相色譜-質譜（LC-MS）鑒定其表面蛋白，初步研究去除表面蛋白前后副干酪乳酪桿菌K56對黏蛋白、膠原蛋白和Caco-2細胞的體外黏附能力，闡釋表面蛋白介導腸道細胞黏附作用，旨在為解析副干酪乳酪桿菌K56調節腸道功能作用提供理論基礎，并為其在益生菌領域的產品開發與應用拓展新的方向。

1副干酪乳酪桿菌K56的益生特性

1.1副干酪乳酪桿菌K56人工胃腸液耐受性

乳酸菌的耐胃腸道消化能力是評判乳酸菌是否具有潛在益生特性的重要指標。本研究以鼠李糖乳酪桿菌LGG和實驗室保藏的干酪乳酪桿菌NSD-1為對照菌株，鼠李糖乳酪桿菌LGG是目前研究最為廣泛的商業益生菌之一，在人體胃腸道中具有良好的黏附能力，干酪乳酪桿菌NSD-1在實驗室前期研究中已被證明具有高酸和膽汁耐受性。如表1所示，在胃液中消化2 h，副干酪乳酪桿菌K56存活率為（94.90±2.96）%，消化3 h存活率為（88.78±3.31）%，劉銀輝等的研究表明副干酪乳酪桿菌RH17965在人工胃液中處理3 h存活率為84.30%；唐素婷等在研究副干酪乳酪桿菌HT31益生性質時，發現菌株在胃液中耐受3 h后存活率為86.33%。相比而言，本實驗中副干酪乳酪桿菌K56對胃液的耐受能力更強。將菌液轉接到人工腸液中繼續培養2 h，副干酪乳酪桿菌K56存活率為（91.57±2.24）%，顯著高于對照菌株干酪乳酪桿菌NSD-1（P＜0.05），表現出良好的人工胃液耐受能力。

1.2副干酪乳酪桿菌K56抑菌能力與抗氧化活性

圖1A～C為3 種乳酸菌對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑制作用。其中，副干酪乳酪桿菌K56對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有顯著的生長抑制作用，抑菌圈直徑分別為（19.91±0.24）mm和（19.00±0.22）mm，優于劉妍妍研究中副干酪乳酪桿菌NCU622對大腸桿菌（（14.17±1.04）mm）和金黃色葡萄球菌（（14.57±0.40）mm）的抑制作用。乳酸菌通過競爭性占位在宿主腸黏膜上形成生物屏障，同時產生有機酸、過氧化氫或分泌細菌素，抑制病原菌生長。

如圖1D所示，副干酪乳酪桿菌K56 CFS的DPPH自由基清除率為（96.29±0.21）%，顯著高于CFE和IC（P＜0.05），3 株乳酸菌CFS中可能存在超氧化物歧化酶、胞外多糖、醛類和多酚類等物質，具有強抗氧化活性和抑菌能力，對指示菌具有抑制作用。如圖1E所示，副干酪乳酪桿菌K56 CFE、IC的Fe3+還原能力與干酪乳酪桿菌NSD-1相比無顯著差異（P＞0.05）。如圖1F所示，副干酪乳酪桿菌K56的總抗氧化能力顯著高于鼠李糖乳酪桿菌LGG（P＜0.05）。副干酪乳酪桿菌K56強抗氧化特性使其在食品加工中具備改善食品風味、延長保質期和減少自由基積累等有益作用。綜上可知，副干酪乳酪桿菌K56憑借優良的胃腸道耐受性、抑菌性和抗氧化能力，可以更好地在腸道中發揮益生能力。

1.3副干酪乳酪桿菌K56的表面疏水性、自凝聚性

由圖 2A可知，副干酪乳酪桿菌K56對二甲苯的表面疏水性為（26.24±0.53）%，顯著高于對照菌株鼠李糖乳酪桿菌LGG與田原等研究的副干酪乳酪桿菌L1。細菌表面疏水性與其表面蛋白等結構相關，疏水性較高的菌株，對腸道具有較高的黏附能力。副干酪乳酪桿菌K56對氯仿的親和力明顯高于對乙酸乙酯的親和力（P＜0.05），說明其供電能力更強。氯仿為單極、酸性溶劑，可作為電子受體用于評測菌體表面的供電子能力；而乙酸乙酯為單極、堿性溶劑，作為電子供體用于評測菌體表面的得電子能力。

乳酸菌的自凝聚作用是其黏附腸道細胞的第1步，有助于在宿主腸道內黏附定植。由圖2B可知，隨著時間的延長，副干酪乳酪桿菌K56的自聚性也不斷提高，在整個靜置過程中自凝聚能力均高于對照菌株干酪乳酪桿菌NSD-1，5 h的自凝聚率達到（28.47±1.19）%，高于干酪乳酪桿菌NSD-1（（22.87±1.24）%）和趙雪婷等6 h測得的干酪乳酪桿菌NCU011056自凝聚率（（28.29±1.69）%），較高的自凝聚能力可能使副干酪乳酪桿菌K56具有較高的腸上皮細胞黏附能力，在胃腸道環境中具有競爭優勢。

2 副干酪乳酪桿菌K56表面蛋白對腸上皮細胞黏附能力的分析與鑒定

2.1副干酪乳酪桿菌K56表面蛋白的提取工藝優化

乳酸菌特異性黏附主要是細菌表面黏附素與細胞表面或者黏附受體相結合。酸性氯化鋰屬于強陽離子解離劑，能夠破壞細菌表面蛋白中以非共價鍵形式存在的氫鍵，提取表面蛋白的同時不會使菌體失去活性。從圖3A可以看出，酸性氯化鋰比鹽酸胍溶液提取的表面蛋白含量高。當菌體與酸性氯化鋰料液比為1∶3（g/mL）時，所提取的表面蛋白質量濃度最高（圖3B）。當處理時間為30 min與40 min時，提取蛋白質量濃度最高，兩組無顯著差異（P＞0.05）（圖3C）。因此，確定了副干酪乳酪桿菌K56表面蛋白的提取工藝：每1 g菌體中加入3 mL的5 mol/L酸性氯化鋰溶液（pH 2.0），冰水浴處理30 min提取表面蛋白。

如圖4所示，5 mol/L酸性氯化鋰法提取的副干酪乳酪桿菌K56表面蛋白條帶在25～50 kDa比較集中，在10～17、70～95 kDa和170～180 kDa處也有條帶分布。

2.2去除表面蛋白前后副干酪乳酪桿菌K56的體外黏附能力

由圖5A、C可知，副干酪乳酪桿菌K56對黏蛋白、膠原蛋白和Caco-2細胞的黏附率分別為（78.70±3.41）%、（80.06±0.75）%和（11.98±0.09）%，對蛋白的黏附能力顯著優于干酪乳酪桿菌NSD-1（P＜0.05），與鼠李糖乳酪桿菌LGG對膠原蛋白的黏附能力無顯著差異（P＞0.05），副干酪乳酪桿菌K56對Caco-2細胞的黏附能力優于Bengoa等從開菲爾中分離的副干酪乳酪桿菌CIDCA 8339。副干酪乳酪桿菌K56對蛋白和Caco-2細胞具有良好的體外黏附能力。

為進一步驗證表面蛋白在乳酸菌黏附過程中發揮的作用，對去除表面蛋白的乳酸菌黏附蛋白和Caco-2細胞的能力進行了探究，Caco-2細胞作為成熟的腸上皮細胞模型，可用于研究益生菌的黏附性。如圖5B、C所示，去除表面蛋白后，副干酪乳酪桿菌K56對黏蛋白、膠原蛋白和Caco-2細胞的黏附率分別為（71.00±0.41）%、（71.29±1.02）%和（8.92±0.21）%，黏附率分別下降了7.70%、8.77%和3.06%。由此推測表面蛋白可作為黏附因子幫助乳酸菌定植于腸道。

如圖6A所示，綠色熒光為FITC標記的副干酪乳酪桿菌K56，藍色為Hoechst 33342標記的Caco-2細胞核，可以清晰地看到副干酪乳酪桿菌K56大量黏附于Caco-2細胞表面，而去除表面蛋白的副干酪乳酪桿菌K56對細胞的黏附數量明顯降低（圖6B）。

2.3副干酪乳酪桿菌K56表面蛋白的鑒定

本課題組前期對嗜酸乳酪桿菌、羅伊氏乳酪桿菌、干酪乳酪桿菌的表面蛋白進行了研究，發現不同乳酸菌表面蛋白組成存在差異性。嗜酸乳酪桿菌S-層蛋白為表面蛋白的主要成分，具有黏附腸道細胞作用而發揮腸道免疫調節活性；羅伊氏乳酪桿菌LPXTG基序蛋白為表面蛋白的主要成分，介導了與腸道細胞的黏附，具有抗炎、抗氧化等作用。本研究通過對副干酪乳酪桿菌K56表面蛋白進行鑒定，發現副干酪乳酪桿菌K56主要包括LPXTG基序蛋白如LPXTG細胞壁錨定蛋白（170 kDa）、轉肽酶（30 kDa）、含LPXTG結構域蛋白（46 kDa）和兼職蛋白甘油醛-3-磷酸脫氫酶（37 kDa）、伴侶蛋白GroEL（58 kDa）、烯醇化酶（47 kDa）、熱不穩定延伸因子（44 kDa）、伴侶蛋白GroES（10 kDa）等（表2），與2.2.1節中SDS-PAGE條帶分布范圍一致。

有研究表明，乳酸菌的表面蛋白組分可以與黏附受體相互作用，如約翰遜乳酪桿菌EF-Tu可結合人體細胞和黏蛋白，卷曲乳酪桿菌的GPI可結合層黏連蛋白和膠原蛋白，Sortase突變可降低乳酸菌對Caco-2細胞的黏附。本研究發現，副干酪乳酪桿菌K56對黏蛋白、膠原蛋白和Caco-2細胞的黏附能力強，去除表面蛋白后黏附能力均下降，可能是其表面存在的LPXTG基序蛋白和兼職蛋白相互作用，共同發揮黏附因子功能從而介導腸道細胞黏附。另外，副干酪乳酪桿菌K56具有良好的胃腸道耐受性能及益生性能，推測其表面蛋白在介導細菌黏附和發揮生物效應方面起到了至關重要的作用，具體黏附的作用機制仍需進一步探索。

結論

本實驗以副干酪乳酪桿菌K56為研究對象，研究其在胃腸道環境中的耐受性、黏附特性和表面蛋白介導副干酪乳酪桿菌K56黏附腸上皮細胞中的作用。結果表明，副干酪乳酪桿菌K56在模擬胃腸液環境中存活性能良好；具有高疏水性和高自凝聚性；對黏蛋白、膠原蛋白和Caco-2細胞有良好的黏附能力。副干酪乳酪桿菌K56存在多種表面蛋白，其表面蛋白憑借獨特的理化特性可能對菌株耐胃腸液能力、表面性質和黏附產生積極影響，從而介導副干酪乳酪桿菌K56與胞外基質、腸上皮細胞的黏附及發揮生物學效應。通過LC-MS鑒定出副干酪乳酪桿菌K56的LPXTG基序蛋白和多種兼職蛋白，如熱不穩定延伸因子、烯醇化酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶，可能對腸上皮細胞的黏附具有決定性的作用。本研究可為后續副干酪乳酪桿菌K56表面蛋白的功能和黏附機制解析奠定基礎。

作者簡介

通信作者：

郭宇星，教授、博士生導師，南京師范大學科學技術研究院副院長、食品與制藥工程學院副院長。江蘇省“333高層次人才培養工程”培養對象；南京師范大學百名青年領軍人才；南師大青藍工程優秀骨干教師；南師大優秀教師、優秀黨務工作者；美國加州大學戴維斯分校訪問學者。先后主持國家自然科學基金4 項，江蘇省農業科技自主創新資金等省級項目10余項；發表SCI及EI論文100余篇，申請及授權國家發明專利30余項；分別獲江蘇省、浙江省科技進步獎二等獎2 項、寧波市科技進步二等獎2 項。

本文《副干酪乳酪桿菌K56表面蛋白及其黏附性能分析》來源于《食品科學》2024年45卷第22期94-102，作者：吳 梵，馬國文，曾照中，洪維鍊，倪 丹，郭宇星*。DOI : 10.7506/spkx1002-6630-20240213-070。點擊下方閱讀原文即可查看文章相關信息。

實習編輯：林安琪；責任編輯：張睿梅。點擊下方閱讀原文即可查看全文。圖片來源于文章原文及攝圖網

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