對于生物體系中自由基對及其量子特性的理解仍處于起步階段，這主要受限于高靈敏度儀器的缺乏，以及生化反應的復雜性和磁場誘導自由基對反應的微弱變化（低至或低于百分之一）。該研究團隊設計的新型光學系統能以高信噪比捕捉生物體系的量子力學特性。開發的磁熒光波動顯微光譜技術可檢測低至0.2%的熒光信號磁場效應（接近單光子水平，采用單光子雪崩二極管），并在23種分子上驗證了該技術的有效性。該系統還配備了電子倍增電荷耦合器件（EMCCD）相機作為輔助檢測模塊，通過新型數字鎖相放大技術實現相位敏感的磁場空間分布成像。上述功能在模型生物體系的自由基對光化學反應中得到驗證。該儀器通過磁場效應揭示了蛋白質-黃素相互作用中光降解現象的重要性，這一發現將為探索生物環境中的類似量子效應提供關鍵研究工具。

Luke P. Lee認為[1]：“Lewis Antill 和同事在 Nature Photonics 上撰文，開發了一種磁熒光波動顯微光譜（MFFMS）技術，該技術允許在接近單分子水平上監測蛋白質-配體復合物中的量子相干效應，有望在生物系統中應用。”

圖1 MFFMS實驗原理圖

研究生物體系中的自由基對需要多種技術手段來揭示其復雜機制。該研究將熒光波動光譜(FFS)與磁場效應(MFE)方法相結合，通過監測黃素熒光的變化，MFFMS技術可提供多種定量信息，包括距離測量、結合狀態、擴散系數、分子數量、自由基對動力學以及蛋白質-配體和蛋白質-蛋白質相互作用等。

對比傳統技術局限，本研究的解決方法：

圖2 基于SPAD檢測的模型體系MFE研究

SPAD技術實現了模型體系中黃素蛋白復合物的超高靈敏度MFE檢測，首次在約7光子水平解析了自由基對的量子動力學行為。研究發現，黃素光降解產物（如缺失磷酸基的光黃素）會顯著影響蛋白-配體相互作用，其中溶菌酶（HEWL）與黃素單核苷酸（FMN）通過表面靜電作用形成非特異性結合，而牛血清白蛋白（BSA）與FMN則呈現特異性口袋結合，二者表現出截然不同的MFE響應模式：HEWL-FMN體系隨流速變化顯示三重態自由基對主導的MFE變化，而BSA-FMN在高流速時出現單重態自由基對特征。這些發現不僅揭示了蛋白結合特性與自由基對自旋態的構效關系，更為在活細胞環境中研究生物量子效應建立了高靈敏度的檢測新范式。

創新點圖示：

圖3 EMCCD檢測的MFE與數字鎖相（DLIA）分析

此外，創新性地開發了基于EMCCD- DLIA聯用的空間分辨磁場效應檢測技術，通過0.25 Hz磁場調制和數字鎖相放大方法，成功實現了對HEWL-FMN自由基對200 ms響應時間的精確測量（上升/衰減速率分別為4.76±0.98 s?1和5.08±0.95 s?1）。該技術將MFE檢測靈敏度提升至-1.37%（較原始數據提高2.3倍），并具備單次試驗處理16800幀圖像的高通量分析能力，有效克服了活細胞環境中的光漂白干擾。通過13階諧波重構的FFT/IFFT（快速傅里葉變換/逆快速傅里葉變換）算法，首次實現了0.1%級弱信號的精準提取，為亞細胞尺度量子生物學研究提供了兼具空間分辨率和時間精度的創新工具。

創新點圖示：

圖4 BSA-FMN復合物的競爭性結合實驗與模擬分析

通過分子對接、競爭性結合實驗和分子動力學模擬，系統揭示了BSA蛋白中FMN通過特異性結合口袋2（與W211殘基形成≤4?關鍵間距）產生單重態自由基對的分子機制。實驗證實該結合可被萘普生（Kd=5.8×10-7 M）競爭性抑制，而MD模擬顯示FMN在口袋內的動態擴散（3.5-6.5 ?）維持了自旋相干所需的電子間距，這為理解流速依賴性MFE變化提供了結構基礎，首次建立了蛋白質結合微環境與自由基對量子行為的定量構效關系。

創新點圖示：

本研究首次實現SPAD的MFE檢測，為單分子水平研究蛋白質-配體的磁敏感光化學開辟了新途徑。DLIA分析進一步實現了熒光圖像中的MFE提取，通過剔除雜散信號，為定位細胞內的磁敏感位點提供了有力工具。結合熒光強度、各向異性和MFE的多參數測量，可更全面揭示蛋白質-配體動力學本質。未來將通過安裝時間相關器，實現SC-AOTF（超連續光源-聲光可調濾光片組合）與SPAD聯用的皮秒時間分辨測量（如熒光壽命成像、時間分辨FRET（熒光共振能量轉移）及MFE）。增設第二個SPAD將支持熒光互相關光譜和FRET測量，結合現有技術，目前已在黃素和黃素蛋白的體外/體內環境中展開應用。

參考文獻：

[1] Lee L P. Single-photon quantum effects in biomolecules[J].Nature Photonics, 2025: 1-2.