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導(dǎo)讀

背景：非酒精性脂肪肝（NAFLD）是全球范圍內(nèi)日益嚴(yán)重的慢性肝病，目前尚無有效的治療藥物。中醫(yī)（TCM）在中國和其他亞洲國家已有數(shù)千年的歷史，被認(rèn)為是發(fā)現(xiàn)治療各種疾病的新藥的重要來源。苗藥銀丹心腦通方（YDX）是通過降低血脂含量來治療高脂血癥的經(jīng)典中藥，但其在NAFLD中的作用尚未明確。

目的：探討YDX對高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD模型小鼠的保護(hù)作用，并闡明其潛在機(jī)制。

方法：通過HFD飼養(yǎng)10周來構(gòu)建NAFLD小鼠模型，并給予YDX用于改善治療。我們進(jìn)行了血脂代謝指標(biāo)、生化指標(biāo)和組織病理學(xué)染色，以評估肝臟脂質(zhì)積累和肝脂肪變性的程度；16S rRNA測序用于確定腸道微生物組成；我們采用血清代謝組學(xué)通過UPLC-Q-TOF/MS分析研究NAFLD相關(guān)生物標(biāo)志物的變化，隨后通過肝臟轉(zhuǎn)錄組學(xué)鑒定差異表達(dá)基因并探索基因調(diào)控途徑，通過Western blot和ELISA檢測脂質(zhì)代謝相關(guān)蛋白和炎癥因子。

結(jié)果：YDX能顯著降低模型小鼠的體重增加、肝臟指數(shù)和炎癥細(xì)胞因子水平，改善肝脂肪變性、血脂水平、對胰島素的敏感性和對葡萄糖的耐受性，并增強(qiáng)了氧化防御系統(tǒng)。此外還顯著影響了腸道微生物群的多樣性和群落豐富度，降低了厚壁菌門/擬桿菌門的比例。同時(shí)YDX還能減少模型小鼠血清中有害脂質(zhì)代謝物的產(chǎn)生，如LPC(18:0)、LPC(18:1)和肉堿。值得注意的是，與肝臟轉(zhuǎn)錄組學(xué)結(jié)果一致，YDX通過激活A(yù)mpk通路，下調(diào)了肝臟中與脂質(zhì)從頭合成有關(guān)的蛋白（Srebp-1c、Acaca、Fasn、Scd-1和Cd36）和促炎細(xì)胞因子（IL-6和TNF-α）的表達(dá)，并增加了與脂肪酸β氧化有關(guān)的蛋白（Ampkα、Ppar-α和Cpt-1）的表達(dá)。

結(jié)論：YDX通過調(diào)節(jié)Ampk通路、抑制腸道微生物群紊亂和減少有害脂質(zhì)代謝物的產(chǎn)生，有望成為預(yù)防NAFLD的有效療法。

論文ID

原名：Multi-omics joint analysis reveals that the Miao medicine Yindanxinnaotong formula attenuates non-alcoholic fatty liver disease

譯名：多組學(xué)聯(lián)合分析顯示苗藥銀丹心腦通方可減輕非酒精性脂肪肝疾病

期刊：Phytomedicine

IF：6.7

發(fā)表時(shí)間：2024.09

通訊作者：劉林&鄭江&李艷梅

通訊作者單位：溫州醫(yī)科大學(xué)，貴州醫(yī)科大學(xué)

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1. YDX降低HFD誘導(dǎo)的NAFLD小鼠的體重和肝臟脂肪堆積

為了研究YDX對NAFLD的治療效果，我們對C57BL/6 J小鼠進(jìn)行了為期10周的HFD喂養(yǎng)。如圖1A-B所示，從第六周開始，HFD組小鼠的體重明顯高于YDX-H組。與HFD組（43.43±3.02 g）相比，YDX-L組（41.12±2.04 g）和YDX-H組（37.25±2.35 g）在YDX干預(yù)10周后的最終體重增加呈降低趨勢。與體重的變化一致，YDX的劑量依賴性逆轉(zhuǎn)了HFD誘導(dǎo)的小鼠附睪脂肪重量的增加（圖1C）。此外與各組小鼠的圖像一致，HFD組的肝臟重量和肝臟指數(shù)顯著高于對照組（P<0.001），而YDX治療顯著逆轉(zhuǎn)了這一變化（圖1D-E）。同樣，HFD組小鼠肝臟形態(tài)粗大、體積增大、外觀呈淡黃色，YDX干預(yù)后顯著緩解了以上癥狀（圖1F）。結(jié)果顯示，喂食高脂飲食的NAFLD小鼠肝臟出現(xiàn)氣球變性、過多脂滴和炎性細(xì)胞浸潤（圖1G-H，藍(lán)黑箭頭所示），表明高脂飲食誘發(fā)了肝臟脂肪變性和炎性病灶。YDX組的肝臟切片顯示出非常輕微的肝臟脂肪變性和炎癥病灶，尤其是在高劑量組。總之以上研究結(jié)果表明，YDX能有效減輕HFD喂養(yǎng)的NAFLD小鼠的肝臟脂肪變性和炎癥浸潤。

圖1 YDX對HFD誘導(dǎo)的NAFLD小鼠的影響。每天分別通過口服灌胃給C57BL/6 J小鼠低劑量YDX（YDX-L，1.0 g YDX/kg BW）、高劑量YDX（YDX-H，4.0 g YDX /kg BW）和生理鹽水（對照組，CN），持續(xù)10周。（A）正常脂肪飲食喂養(yǎng)、高脂飲食喂養(yǎng)和YDX加高脂飲食喂養(yǎng)小鼠的體重變化。（B）最終體重增加值。（C）CN、HFD和YDX組小鼠的腹部脂肪重量。（D-E）第10周CN、HFD組和YDX組小鼠的肝臟重量和肝臟指數(shù)。（F）CN、HFD和YDX組小鼠10周時(shí)肝臟照片。(G-H)用H&E染色的肝組織（×200倍放大）和油紅O染色的肝組織（×400倍放大）顯示小鼠的病理形態(tài)學(xué)變化（n=8）。數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（SD，n=10）。與CN組相比，##P<0.01和###P<0.001；與HFD組相比，*P<0.05、**P<0.01和***P<0.001。

2. YDX可改善高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD小鼠的血清生化指標(biāo)

通常NAFLD疾病會伴隨著葡萄糖穩(wěn)態(tài)和胰島素敏感性受損。為了研究YDX對脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)的影響，我們檢測了小鼠的血清脂質(zhì)指標(biāo)。如圖2A所示，與HFD組相比，隨著YDX劑量的增加，NAFLD小鼠血清TG、TC和LDL-C水平顯著降低，而血清HDL-C水平的變化與YDX劑量呈正相關(guān)。同時(shí)HFD組小鼠血清葡萄糖和胰島素水平分別比空白對照組高0.69倍和1.04倍，而YDX治療后可逆轉(zhuǎn)這些變化，且呈劑量依賴性（圖2B-C）。如圖2D所示與藥物治療相比，低劑量和高劑量YDX也分別顯著降低了HFD組小鼠的HOMD-IR(P<0.05,P<0.001)。此外，我們還通過口服葡萄糖耐量試驗(yàn)（OGTT）進(jìn)一步檢測了HFD組小鼠在服用YDX藥物10周后的葡萄糖清除能力。結(jié)果如圖2E顯示腹腔注射葡萄糖（1.5 g kg-1）后，隨著時(shí)間的延長YDX治療組的血糖水平降低，在120 min時(shí)高劑量YDX組的血糖含量與對照組相似。OGTT的AUC變化表明，與對照組相比，YDX治療顯著提高了HFD誘導(dǎo)的NAFLD小鼠的葡萄糖清除能力（圖2F）。這些數(shù)據(jù)表明，YDX可以回調(diào)高脂飲食誘導(dǎo)小鼠因血脂水平失調(diào)引起的胰島素敏感性和葡萄糖耐量的損傷。

接下來我們探討了YDX對高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD小鼠因脂質(zhì)代謝紊亂引起的肝損傷的影響。如圖2G所示與對照組相比，HFD組小鼠的血清AST和ALT水平分別顯著升高了66.05%和63.9%。盡管如此YDX治療仍能明顯改善這些變化。在HFD組相比，高劑量干預(yù)YDX組的血清AST和ALT水平分別比成功降低了36.2%和38.11%。與血清肝功能指標(biāo)水平的變化一致，HFD組小鼠口服YDX可顯著降低血清MDA水平（P<0.01，P<0.001），且呈劑量依賴性（圖2H）。作為抗氧化系統(tǒng)的關(guān)鍵指標(biāo)，與HFD組相比，GSH/GSSG和GPx的水平會隨著YDX劑量的增加呈現(xiàn)出顯著上升趨勢（圖2I-J）。此外與對照組相比，HFD飼喂導(dǎo)致血清中LPS水平明顯升高，而與HFD組相比，YDX組則顯著降低血清中LPS的含量（圖2K）。同時(shí)HFD組小鼠血清中炎癥細(xì)胞因子IL-6和TNF-α的水平顯著升高（P<0.001），而YDX組小鼠中IL-6和TNF-α的水平顯著低于HFD組（圖2I-M）。

圖2 YDX對HFD誘導(dǎo)的NAFLD小鼠血清生化指標(biāo)和糖耐量的影響。血清中甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）和高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）的水平。(B-F)血清葡萄糖水平、口服葡萄糖耐量試驗(yàn)（OGTT）、OGTT的AUC、血清胰島素和胰島素抵抗的穩(wěn)態(tài)模型評估（HOMA-IR）的變化。（G）CN、HFD和YDX組小鼠的肝功能指標(biāo)ALT和AST水平。(H-J) MDA、GSH/GSSG、GPx、脂多糖水平變化。(I-M)炎癥細(xì)胞因子IL-6、TNF-α的水平。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示（n=10）。與CN組相比，###P<0.001；與HFD組相比，*P<0.05、**P<0.01和***P<0.001。

3. YDX調(diào)節(jié)HFD誘導(dǎo)的NAFLD小鼠的腸道菌群

為了進(jìn)一步研究YDX對NAFLD小鼠腸道微生物群的影響，我們選取了對照組、HFD組和YDX-H組（n=5），通過16S rRNA測序分析腸道微生物群。如圖3A-C所示，與對照組相比，HFD誘導(dǎo)的NAFLD小鼠腸道微生物群的α多樣性顯著降低，而YDX-H組治療后則可恢復(fù)其多樣性。同時(shí)為了研究不同樣本中腸微生物群結(jié)構(gòu)的變化，我們還進(jìn)行了β多樣性測定。如圖3D-F所示，OPLS-DA、PCoA和NMDS的OTU水平分析表明，對照組和HFD組的腸道微生物群之間存在顯著差異，而YDX組與對照組則相互靠近，表明HFD喂養(yǎng)小鼠的腸道微生物群在YDX治療后趨于恢復(fù)到正常水平。上述結(jié)果表明，YDX對HFD誘導(dǎo)的NAFLD小鼠紊亂的腸道微生物群具有顯著的恢復(fù)作用。

此外如圖3G所示，在門的水平上，擬桿菌門、疣微菌門、脫鐵桿菌門、變形菌門和厚壁菌門是最主要的種群，而它們在不同群體腸道微生物群中的相對豐度差異很大。在本研究中HFD組的F/B比值比對照組低60.73%，而YDX治療后F/B比值顯著升高（P<0.05）（圖3H）。從菌屬水平來看，HFD組小鼠中普氏梭桿菌、醋桿菌、顫螺菌、脫硫弧菌、臭桿菌、沙氏粘螺菌和另枝菌屬的相對豐度顯著低于對照組，而巴氏桿菌、羅斯氏菌和梭菌簇XIVa的相對豐度顯著高于對照組（圖3I-J），YDX干預(yù)則顯著逆轉(zhuǎn)了這一變化。此外線性判別分析（LDA）和效應(yīng)大小測量（LEFSe）顯示有27個(gè)高維生物標(biāo)志物顯示出從門到屬的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性和生物學(xué)一致性差異（LDA socre>4）（圖3K），該分析表明有5個(gè)的LDA值大于5.0。此外梭菌簇XIVa、Clostridiales、梭菌屬、厚壁菌門和毛螺菌科被確定為HFD組的生物標(biāo)志物，而脫硫弧菌科、脫硫弧菌屬和變形菌門是YDX回調(diào)更顯著的菌屬。這些結(jié)果表明，YDX可調(diào)節(jié)腸道微生物群的豐度，從而改善高脂飲食所致NAFLD小鼠的肝損傷。

圖3 YDX對NAFLD小鼠腸道微生物群多樣性和群落豐富度的影響。（D）OPLS-DA、（E）基于非加權(quán)Unifrac的PCoA和（F）非計(jì)量多維標(biāo)度（NMDS）圖。(G)門級微生物群組成的平均相對豐度。(H)厚壁菌門與擬桿菌門的比例。(I)屬級的腸道微生物群熱圖。(J)熱圖顯示三組小鼠腸道微生物群在屬一級的相對豐度分析。(K)三組差異微生物群的LDA評分柱狀圖。數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（SD，n =5）。與CN組相比，###P<0.001；與HFD組相比，*P<0.05和**P<0.01。

4. 基于血清非靶向代謝組學(xué)探討YDX對NAFLD的保護(hù)作用

我們采用非靶向代謝組學(xué)方法研究了小鼠血清中代謝物的變化，通過主成分分析（PCA）對QC樣品進(jìn)行聚類分析，結(jié)果表明LC-MS/MS系統(tǒng)和樣品處理過程穩(wěn)定，具有良好的重現(xiàn)性（圖S1A）。PCA評分圖顯示，對照組和HFD組呈顯著差異，這意味著HFD小鼠存在明顯的代謝紊亂，而YDX治療后代謝紊亂得到顯著改善（圖4A）。這些結(jié)果表明，YDX可調(diào)節(jié)HFD引起的代謝紊亂。隨后，我們建立了OPLS-DA模型來分析對照組、HFD組和YDX-H組小鼠的代謝變化。如圖4B所示，在OPLS-DA評分圖中，對照組、HFD組和YDX-H組之間顯著分離。R2Y表示模型對Y矩陣的解釋率和Q2模型的預(yù)測能力，結(jié)果表明該模型具有良好的擬合度和預(yù)測能力。

隨后，我們根據(jù)VIP>2、FC>1和P<0.05來確定各組間顯著改變的代謝物，在HFD組小鼠中篩選出50種代謝物，YDX干預(yù)小鼠中篩選出43種差異代謝物。隨后，我們選擇這些代謝物進(jìn)行t檢驗(yàn)分析，以找到特定的代謝生物標(biāo)志物。結(jié)果表明有11種差異代謝物對小鼠血清代謝的影響（圖4I和圖S1B）。在這11種血清生物標(biāo)記物中，與對照組相比，HFD組有4種標(biāo)記物（如LPC(18:0)、LPC(18:1)、LPC(14:0)和肉堿）顯著增加，7種標(biāo)記物（油酰-l-肉堿、3-羥基丁酰肉堿、3-羥基油酰肉堿、l-棕櫚酰肉堿、己酰-l-肉堿和亞油酰肉堿）顯著減少。與HFD組相比，這個(gè)11種生物標(biāo)志物在YDX干預(yù)后得到了一定程度的恢復(fù)，這表明YDX能有效改善NAFLD小鼠血清中異常生物標(biāo)志物的水平。

圖4 YDX治療對HFD誘導(dǎo)的NAFLD小鼠血清代謝譜的影響。（A）CN組、HFD組和YDX-H組血清代謝譜的PCA評分圖。（B）OPLS-DA評分圖。(C) HFD組與CN組差異代謝物火山圖。(D) YDX-H vs HFD差異代謝物火山圖。(E-F) CN 組和HFD組血清代謝譜的OPLS-DA評分圖及模型排列圖。（G-H）HFD組和YDX組的OPLS-DA評分圖及模型的排列圖。（I）11種不同代謝物的相對豐度。數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（SD，n=5）。與CN組相比，###P<0.001、##P<0.01和#P<0.05；與HFD組相比，*P<0.05、**P<0.01和***P<0.001。

5. YDX影響NAFLD小鼠肝臟中的基因表達(dá)

接下來，我們通過RNAseq分析評估了YDX治療NAFLD小鼠肝臟脂肪變性的改善是否與肝組織中基因表達(dá)譜的調(diào)控有關(guān)。如圖5A所示，PCA圖顯示三組之間有顯著分離，而YDX組比HFD組更接近對照組，這表明YDX組比HFD組與對照組有更高的相似性。圖5B顯示了差異表達(dá)基因（DEGs）在HFD組小鼠中的顯著變化，包括1390個(gè)上調(diào)基因和1432個(gè)下調(diào)基因。與HFD組相比，YDX治療后HFD組小鼠有701個(gè)基因上調(diào)，604個(gè)基因下調(diào)。熱圖分析表明，YDX的干預(yù)逆轉(zhuǎn)了HFD導(dǎo)致的代謝紊亂小鼠中679個(gè)基因的異常表達(dá)水平，使其恢復(fù)到接近正常水平（圖5D）。

此外，我們還對679個(gè)DEGs進(jìn)行了KEGG通路富集分析。結(jié)果顯示YDX治療NAFLD的機(jī)制主要涉及調(diào)控脂肪酸代謝、PPAR信號通路、類固醇激素的生物合成、不飽和脂肪酸的生物合成、胰島素信號通路、氨基酸的生物合成、丙酮酸代謝、Ampk 信號通路、胰高血糖素信號通路、糖酵解/糖原生成和脂肪酸的生物合成（圖5E）。更具體地說，對整個(gè)轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行的基因組富集分析（GSEA）證實(shí)，HFD誘導(dǎo)的NAFLD小鼠在脂質(zhì)代謝過程和脂肪酸生物合成過程的調(diào)控方面表現(xiàn)出強(qiáng)烈的富集特征，而YDX的干預(yù)則顯著逆轉(zhuǎn)了這些特征（P<0.01）。值得注意的是，參與脂質(zhì)代謝過程和脂肪酸生物合成過程的基因表達(dá)變化與YDX治療后小鼠的體重和血脂水平（TC、TG、LDL-C和HDL-C）密切相關(guān)（圖5H）。

圖5 YDX處理后肝臟的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析。(A) PCA圖。(B) HFD組和對照組以及YDX組和HFD組之間的差異表達(dá)基因（DEGs）。(C) 維恩圖。(D) 三組差異基因表達(dá)的聚類熱圖。(E)脂酸生物合成和脂質(zhì)代謝的基因組富集分析(GSEA)。(F) 脂酸生物合成和脂質(zhì)代謝通路差異基因表達(dá)的聚類熱圖。(H)Spearman熱圖分析。

6. YDX通過調(diào)節(jié)關(guān)鍵脂質(zhì)代謝相關(guān)蛋白的表達(dá)來改善肝脂肪變性

根據(jù)上述結(jié)果，我們確定了YDX治療后NAFLD小鼠肝臟中與脂質(zhì)代謝和脂肪酸生物合成過程相關(guān)的關(guān)鍵調(diào)控基因，隨后利用WB技術(shù)檢測了與脂質(zhì)代謝相關(guān)的關(guān)鍵基因及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的蛋白表達(dá)水平，如Acaca、Fasn、Scd-1、Srebp-1c、Cd36、Ppar-α、Cpt-1和Ampkα（圖6A）。結(jié)果如圖6B-F所示，與對照組相比，HFD組小鼠肝臟中Acaca、Fasn、Scd-1、Srebp-1c和Cd36蛋白表達(dá)量分別顯著增加了1.46倍、1.39倍、3.74倍和0.71倍，而YDX干預(yù)后顯著逆轉(zhuǎn)了這一趨勢，且呈劑量依賴性，尤其是在高劑量組。此外與對照組相比，HFD組的Cpt-1、Ampkα和Ppar-α蛋白表達(dá)發(fā)生了輕微的變化（P>0.05），而YDX則顯著上調(diào)了這些蛋白的表達(dá)（圖6G-I）。

圖6 YDX對小鼠肝臟脂質(zhì)代謝相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響。（A-I）分別給YDX組和HFD組的C57BL/6 J小鼠每天口服低劑量YDX（YDX-L，1.0 g YDX/kg BW）和高劑量YDX（YDX-H，4.0 g YDX /kg BW），持續(xù)10周后進(jìn)行Srebp-1c、Acaca、Fasn、Cd36、Scd-1、Ampkα、Ppar-α、Cpt-1蛋白表達(dá)水平的WB分析。結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示（n=3）。與CN組相比，###P<0.001、##P<0.01和#P<0.05；與HFD組相比，*P<0.05、**P<0.01和***P<0.001。

為了進(jìn)一步研究YDX對脂質(zhì)代謝紊亂的治療作用，我們評估了YDX對油酸（OA）誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞肝脂肪變性模型的保肝作用。如圖7A-B所示，ORO染色顯示，與OA處理組相比，隨著YDX血清濃度的增加，OA誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞中的脂滴積聚顯著減少。圖7C顯示，與正常組相比，OA誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞中TG水平顯著升高，而YDX藥物抑制了OA引起的細(xì)胞TG生成。此外流式細(xì)胞術(shù)和熒光倒置顯微鏡還測定了HepG2細(xì)胞中的ROS水平。與對照組相比，OA處理24 h后，細(xì)胞內(nèi)綠色熒光強(qiáng)度顯著增加，表明OA誘導(dǎo)的脂質(zhì)積累導(dǎo)致HepG2細(xì)胞內(nèi)ROS水平明顯升高（圖7D）。如圖7E-F所示，與OA組相比，YDX藥物血清顯著降低了ROS水平（P<0.001），且呈劑量依賴性。此外，我們還探討了YDX藥物血清對OA誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。如圖7G-I所示，與正常組相比，經(jīng)OA處理24小時(shí)后，AST、ALT和MDA水平顯著升高。相比之下YDX藥物血清干預(yù)逆轉(zhuǎn)了這些變化，尤其是15% YDX藥物血清處理組。OA誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞中GSH/GSSG和GPx的含量分別比未經(jīng)OA預(yù)處理的對照組顯著降低了50.49%和50.71%。如圖7J-K所示，這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了YDX在減輕OA介導(dǎo)的肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積和脂毒性方面的積極作用。

圖7 YDX藥物血清對OA誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞脂質(zhì)積累、氧化應(yīng)激標(biāo)記物和細(xì)胞損傷的影響。(A) OA誘導(dǎo)脂滴積累后HepG2細(xì)胞的油紅O染色（×100）。(B)油紅O染色后用異丙醇洗脫的油紅O染料在530 nm波長處的吸光度。(C)OA誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞中的TG水平。（D）使用熒光顯微鏡（×100）通過DCFH-DA染色法測量細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生。(E-F）用流式細(xì)胞儀和微孔板檢測DCF熒光強(qiáng)度。(G-K)檢測OA誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞的AST、ALT、GSH/GSSG、GPx指標(biāo)水平。結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示（n=3）。與CN組相比，###P<0.001；與HFD組相比，*P<0.05、**P<0.01和***P<0.001。

8. 生化和病理指標(biāo)與腸道微生物群和不同代謝生物標(biāo)志物的相關(guān)性分析

在上述生化指標(biāo)、病理指標(biāo)、腸道微生物群和不同血清代謝生物標(biāo)志物分析的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步分析了高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD小鼠生化指標(biāo)和病理指標(biāo)變化與腸道菌群的相關(guān)性。如圖8A所示，F(xiàn)lavonifractor、Odoribacter、Alistipes、脫硫弧菌屬、Mucispirillum、Acetatifactor、Pseudoflavonifractor 和 Oscillibacter 與HDL-C和GPx呈正相關(guān)，而Ruminoooccus、梭菌簇XIVa和Barnesiella與HDL-C和GPx呈負(fù)相關(guān)；而生化和病理指標(biāo)，包括MDA、LPS、TC、TG、肝重、體重、GLU、IL-6、TNF-α和胰島素，與Odoribacter、Alistipes、脫硫弧菌屬、Mucispirillum、Acetatifactor、Pseudoflavonifractor和Oscillibacter呈負(fù)相關(guān)，與Ruminoooccus、梭菌簇XIVa和Barnesiella呈正相關(guān)。

為了探索生化和病理指標(biāo)與潛在生物標(biāo)志物之間的潛在聯(lián)系，我們分析了16個(gè)生化和病理指標(biāo)與11種差異代謝生物標(biāo)志物之間的相關(guān)性。從熱圖（圖8B）中發(fā)現(xiàn)，4種差異代謝生物標(biāo)志物L(fēng)PC(18:0)、LPC(18:1)和肉堿與MDA、LPS、TC、TG、肝重、體重、GLU、IL-6、TNF-α 和胰島素等生化和病理指標(biāo)呈正相關(guān)，而與HDL-C、GSH/GSSG和GPx分別呈顯著負(fù)相關(guān)。此外，我們還發(fā)現(xiàn)在YDX治療后，小鼠血清中的HDL-C、GSH/GSSG和GPx水平呈上升趨勢，這些指標(biāo)與7種代謝物呈正相關(guān)，與4種代謝物呈負(fù)相關(guān)。

圖8 生化和病理指標(biāo)與腸道微生物群和血清差異代謝生物標(biāo)志物的相關(guān)性分析。(A)Spearman相關(guān)性分析；(B)差異代謝生物標(biāo)志物與生化和病理指標(biāo)數(shù)據(jù)的關(guān)系。圖中的空白區(qū)域表示P>0.05，星號（*、**和***）標(biāo)記的區(qū)域表示P<0.05，P<0.01，P<0.001。

結(jié)論

NAFLD正迅速成為一種全球流行病，也是慢性肝病的最常見原因，在全球范圍內(nèi)造成了廣泛的醫(yī)療保健和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。而長期攝入高脂肪飲食是NAFLD的主要原因之一，可引發(fā)新陳代謝紊亂、腸道菌群失衡、氧化應(yīng)激、胰島素抵抗和促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，這些與NAFLD的發(fā)生密切相關(guān)。然而目前除了通過改變生活方式進(jìn)行早期預(yù)防外，沒有有效的藥物可用于預(yù)防和治療NAFLD。因此迫切需要開發(fā)能夠阻止或逆轉(zhuǎn)NAFLD進(jìn)展的有效多靶點(diǎn)藥物。在本研究初步實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)YDX是一種傳統(tǒng)的苗藥，可有效減輕HFD誘導(dǎo)的NAFLD小鼠的體重并改善肝脂肪變性。然而YDX如何抑制NAFLD進(jìn)展的機(jī)制尚不清楚。

體重增加、胰島素抵抗、糖脂代謝紊亂、肝脂肪變性、抗氧化防御功能下降和炎癥反應(yīng)是脂質(zhì)代謝紊亂引起的NAFLD的常見特征。在本研究中YDX組小鼠用YDX（1.0 和 4.0 g YDX/kg BW）干預(yù)并喂食HFD，持續(xù)治療10周。YDX治療顯著降低了體重增加、肝臟指數(shù)和血清促炎細(xì)胞因子水平（TNF-α、IL-6），同時(shí)還改善了HFD誘導(dǎo)的NAFLD小鼠的血脂代謝和肝脂肪變性。這些結(jié)果表明，YDX通過抑制脂質(zhì)代謝紊亂和炎癥反應(yīng)，有效緩解HFD誘導(dǎo)的NAFLD小鼠的進(jìn)展。此外YDX干預(yù)顯著降低了血清胰島素和葡萄糖水平，并改善了葡萄糖耐受不良和胰島素抵抗，這是促進(jìn)NAFLD和NASH進(jìn)展的關(guān)鍵驅(qū)動因素。值得注意的是，YDX顯著逆轉(zhuǎn)了NAFLD小鼠GPx和GSH/GSSG水平的降低以及肝功能指數(shù)和MDA水平的增加，從而防止了脂毒性引起的肝損傷，這與之前的研究一致。以上結(jié)果表明，YDX可有效抑制HFD誘導(dǎo)的小鼠NAFLD的進(jìn)展。因此，了解YDX作用的具體機(jī)制需要進(jìn)一步研究，這可能為NAFLD的臨床治療提供潛在的新策略。

近年來，大量研究表明，腸道菌群的組成和多樣性與各種代謝疾病密切相關(guān)，包括NAFLD和糖尿病。在這項(xiàng)研究中，16S rRNA測序分析表明，HFD喂養(yǎng)可顯著改變了NAFLD小鼠腸道微生物群的組成和多樣性，這與之前的研究一致，而這在YDX治療后往往會恢復(fù)到健康狀態(tài)。特別是厚壁菌門和擬桿菌門是人類腸道菌群中的兩個(gè)優(yōu)勢門，厚壁菌門與擬桿菌門的比例（F/B）與代謝穩(wěn)態(tài)的維持密切相關(guān)，該比例的變化可能導(dǎo)致NAFLD。本研究發(fā)現(xiàn)，YDX增加了HFD降低的F/B比率，表明YDX參與了腸道微生態(tài)平衡的調(diào)節(jié)。此外變形菌門也是腸道菌群的主要成分之一，通過產(chǎn)生促炎因子（包括LPS）與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，因此在HFD誘導(dǎo)的NAFLD的進(jìn)展中起關(guān)鍵作用。在本研究中NAFLD小鼠中變形菌門的豐度高于正常組，而YDX在門水平上變形菌門的相對豐度有輕微的恢復(fù)趨勢。

在屬水平上，HFD組Odoribacter、Alistipes、Flavonifractor、Oscillibacter、Pseudoflavonifractor、脫硫弧菌屬、Mucispirillum和Acetatifactor的相對豐度與正常小鼠相比顯著降低，而梭菌簇XIVa和Barmesiella的相對豐度正好相反（圖S2A-K）。然而在YDX干預(yù)后都顯示出回調(diào)的變化。先前的研究報(bào)告稱，Odoribacter、Alistipes、Acetatifactor、Oscillibacter、Acetatifactor和Pseudoflavonifractor對產(chǎn)生短鏈脂肪酸（SCFA）的腸道菌群有益，以增強(qiáng)腸道屏障并降低腸道通透性和LPS水平。研究還顯示類似的結(jié)果，YDX干預(yù)后NAFLD小鼠Odoribacter、Alistipes、Acetatifactor、Oscillibacter、Flavonifractor和Pseudoflavonifractor的豐度變化與血脂水平（TG、TC和LDL-C）和血清炎癥因子（TNF-α、IL-6 和 LPS）水平呈負(fù)相關(guān)。脫硫弧菌屬與NAFLD小鼠的肝脂肪變性和肝脂質(zhì)代謝呈負(fù)相關(guān)，這與我們的發(fā)現(xiàn)一致。此外Mucispirillum是一個(gè)與HFD誘導(dǎo)的NAFLD小鼠脂質(zhì)代謝紊亂改善相關(guān)的菌屬，其豐度在YDX治療組中顯著增加，并且與TG和TC呈負(fù)相關(guān)。此外先前的研究表明，HFD導(dǎo)致梭菌簇XIVa和Barmesiella的豐度增加，從而導(dǎo)致脂質(zhì)代謝紊亂和肝脂肪變性，促進(jìn)NALFD的進(jìn)展。研究表明，YDX處理的小鼠中梭菌簇XIVa和Barmesiella的豐度顯著降低。這些結(jié)果表明，YDX干預(yù)可通過抑制腸道菌群失衡和增加腸道菌群的組成和多樣性，有效改善HFD引起的NAFLD的發(fā)展。

大量研究表明，HFD可導(dǎo)致正常小鼠和NALFD小鼠之間血清中代謝物質(zhì)的差異變化，因此血清生物標(biāo)志物代謝物也是反映體內(nèi)代謝狀態(tài)是否正常的關(guān)鍵指標(biāo)。在本研究中結(jié)果顯示YDX治療后HFD誘導(dǎo)的NALFD小鼠中LPC（18：0）、LPC（18：1）、LPC（14：0）和肉堿等11種潛在生物標(biāo)志物顯著逆轉(zhuǎn)。LPC主要由PLA2催化的磷脂酰膽堿（PC）形成，并導(dǎo)致巨噬細(xì)胞浸潤和活化，分泌炎性細(xì)胞因子，加劇肝臟炎癥、脂質(zhì)代謝失衡和脂質(zhì)積累誘導(dǎo)的肝損傷，在我們的研究中也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果，LPC（18：0）、LPC（18：1）和LPC（14：0）與炎性細(xì)胞因子（IL-6 和 TNF-α）、肝功能指標(biāo)（ALT、AST和MDA）和血脂水平（TG和TC）呈正相關(guān)，與HDL-C、GSH/GSSG和GPx水平呈負(fù)相關(guān)。此外由過度脂質(zhì)積累引起的脂毒性可下調(diào)肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶I（Cpt-I）表達(dá)，從而防止肉堿和長鏈酰基結(jié)合形成酰基肉堿，導(dǎo)致肉堿含量增加和酰基肉堿含量降低。此外YDX給藥后，β-羥基丁酸酯的相對豐度顯著增加。因此YDX處理可能上調(diào)Cpt-1的表達(dá)，導(dǎo)致HFD誘導(dǎo)的NAFLD小鼠肉堿含量顯著降低和酰基肉堿水平增加，進(jìn)而增加脂肪酸β氧化。這些結(jié)果表明YDX可以通過促進(jìn)脂肪酸β氧化和抑制有害代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生來改善脂質(zhì)代謝紊亂、肝損傷和炎癥反應(yīng)，從而緩解NAFLD的發(fā)展。

在本研究中，YDX處理的HFD誘導(dǎo)的NAFLD小鼠肝脂肪變性的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析表明，脂肪酸生物合成和脂質(zhì)代謝的改變是受YDX處理影響最顯著的途徑。與以往的研究一致，高脂飲食引起的脂肪酸生物合成基因表達(dá)上調(diào)和脂質(zhì)氧化基因表達(dá)下調(diào)與NAFLD的發(fā)生密切相關(guān)。因此，YDX可能通過重塑肝臟脂質(zhì)代謝對NAFLD發(fā)揮治療作用。本研究進(jìn)一步分析顯示YDX干預(yù)顯著上調(diào)與脂肪酸氧化相關(guān)的蛋白質(zhì)及其關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子（Ampkα、Ppar-α和Cpt-1）的表達(dá)，并降低與脂肪酸合成相關(guān)的蛋白質(zhì)如Cd36、Srebf1（Srebp-1c）、Acaca、Fasn和Scd-1的表達(dá)，從而降低肝臟脂質(zhì)積累引起的脂毒性和炎癥反應(yīng)（圖S3A-B）。作為脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，p-Ampkα可以通過下調(diào) Srebf1（Srebp-1c）的蛋白表達(dá)來增加Ppar-α蛋白表達(dá)和抑制脂肪酸合成途徑，從而上調(diào)Cpt-1的表達(dá)以促進(jìn)脂質(zhì)降解，表明Ampkα可能是YDX調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的靶標(biāo)之一。先前的一項(xiàng)研究表明，Srebp-1c是脂肪酸合成的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，可以上調(diào)脂質(zhì)合成酶Acaca、Fasn和Scd-1，從而促進(jìn)脂質(zhì)合成和脂肪積累。此外Cd36被稱為脂肪酸轉(zhuǎn)位酶，可增強(qiáng)血清中細(xì)胞游離脂肪酸的攝取，進(jìn)而增加肝細(xì)胞中的脂質(zhì)積累。此外我們進(jìn)一步驗(yàn)證了YDX藥物血清對游離脂肪酸誘導(dǎo)的肝脂肪變性細(xì)胞模型的緩解作用。結(jié)果顯示，YDX藥物血清顯著降低了細(xì)胞模型中脂質(zhì)積累、ROS水平以及TG和MDA含量，并提高了游離脂肪酸還原的GPx和GSH/GSSG含量，表明YDX中的活性成分還可以通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝和抑制脂毒性直接發(fā)揮保肝作用。以上結(jié)果表明，YDX可通過激活A(yù)mpk通路有效抑制脂肪酸從頭合成，促進(jìn)脂肪酸氧化，增強(qiáng)抗氧化系統(tǒng)功能，從而改善脂質(zhì)積累誘導(dǎo)的肝脂肪變性和肝細(xì)胞損傷。

結(jié)論

總之結(jié)果證明，YDX緩解了HFD誘導(dǎo)NAFLD小鼠疾病的發(fā)展。根據(jù)16S RNA序列、血清代謝組學(xué)和肝臟轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析的研究，其潛在機(jī)制可能涉及YDX表現(xiàn)出的抗NAFLD作用：（1）YDX可以通過增加腸道菌群的組成和多樣性，降低厚壁菌門與擬桿菌門的比例，顯著抑制促炎因子引起的炎癥反應(yīng)，改善NAFLD小鼠腸道菌群紊亂;（2）YDX可通過激活A(yù)mpk途徑促進(jìn)脂肪酸氧化，抑制從頭脂肪酸，增強(qiáng)抗氧化系統(tǒng)功能，顯著減少肝臟脂肪變性、肝損傷和脂質(zhì)積累過多引起的有害脂質(zhì)代謝物的產(chǎn)生（圖9）。總之研究表明YDX在緩解HFD誘導(dǎo)NAFLD方面發(fā)揮了積極作用，這可能為NAFLD的臨床治療提供潛在的新策略。

圖9 YDX對NAFLD的保護(hù)作用機(jī)制示意圖

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39388921/

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