【寫在前面】：本期推薦的是由浙江工業大學、浙江中醫藥大學第一附屬醫院等研究團隊近期發表于Phytomedicine(IF=6.7）的一篇文章，揭示改良型黃風湯通過激活自噬和調節腸道菌群緩解糖尿病腎病。

【期刊簡介】

【題目及作者信息】

Modified huangfeng decoction alleviates diabetic nephropathy by activating autophagy and regulating the gut microbiota

背景：糖尿病腎病（DN）是糖尿病患者中死亡率最高的并發癥之一，可導致腎衰竭。改良型黃風湯（MHD）在腎臟疾病的臨床治療中被廣泛應用。然而，MHD對DN的具體作用機制尚未完全闡明。

目的：探討MHD對小鼠DN的影響及其潛在機制。

方法：通過液相色譜?質譜分析確定MHD的主要成分。構建高脂飲食聯合鏈脲佐菌素（STZ）誘導的DN小鼠模型，并用MHD治療6周。檢測血清和尿液參數，對組織切片進行組織學染色。通過qPCR和Western blotting檢測代謝、炎癥、纖維化和自噬相關標志物的mRNA和蛋白水平。通過全長16S rRNA測序和非靶向代謝組學分析盲腸內容物的微生物組成和代謝物。

結果：MHD改善了DN小鼠的胰島素抵抗，并改善了肝臟和脂肪組織中脂質代謝和炎癥的變化。此外，MHD降低了血清和尿液中腎損傷標志物的水平，并減輕了腎臟的炎癥和纖維化。這些結果伴隨著腸道屏障功能的增強以及腸道菌群組成和代謝物的顯著改變，表現為有益菌種和代謝物的豐度增加。此外，MHD本身及微生物代謝物精脒通過激活PI3K/AKT/mTOR通路減輕了足細胞損傷。

結論：MHD可能通過激活足細胞自噬（PI3K/AKT/mTOR通路）以及調節腸道菌群及其代謝物來改善DN。我們的研究為MHD的作用機制提供了更全面的理解，并揭示了腸道?腎臟相互作用在DN進展中的作用，為其在DN治療中的臨床應用奠定了理論基礎。

（PS：不想看長篇大論的可以直接拉到文章最后看全文思路總結）

（圖文摘要）

【前言】

2型糖尿病（T2D）主要由胰島素抵抗和胰腺β細胞功能的逐漸惡化定義。其患病率在全球范圍內持續上升，2021年全球約有5.37億成年人患有T2D。預計到2045年，這一數字將顯著增加，達到約7.83億。這不僅凸顯了T2D對公共衛生構成的日益嚴峻的挑戰，也強調了加強預防和治療策略的緊迫性。然而，糖尿病腎病（DN）的分子機制尚未完全闡明，這阻礙了有效分子干預靶點的識別和開發。目前，主流治療主要集中在控制血壓、血糖和血脂水平。自20世紀90年代初以來，血管緊張素阻滯劑（如ACEI和ARB）在DN的管理中發揮了關鍵作用。近年來，新型療法（如SGLT2抑制劑、內皮素受體拮抗劑、GLP-1受體激動劑和鹽皮質激素受體拮抗劑）提供了額外的治療選擇。然而，部分患者仍不可避免地進展為終末期腎病，這突顯了對新療法的迫切需求。

中醫藥（TCM）基于其整體理論框架，通過其生物活性成分的協同作用，在DN的治療中表現出多層次的療效。在植物化學水平上，單味中藥具有特定的生物活性。例如，山藥通過健脾補腎改善DN。此外，黃芪通過其多種植物成分調節糖脂代謝，并降低空腹高血糖、蛋白尿和腎小球高濾過等病理標志物水平。這些單味中藥的療效在復方制劑中可能通過成分的協同作用而增強。黃連解毒湯就是一個例子，它結合了四種功能不同的中藥：黃連（降血脂）、黃芩（調節血流動力學）、梔子（抗炎）和黃柏（解毒），并通過激活AGE/RAGE/AKT/Nrf2通路改善DN。同樣，當歸補血湯由黃芪和當歸組成，具有抗炎、鎮痛和降血糖作用，這兩種藥材協同作用增強了對DN的治療效果。這種從單味中藥到優化復方制劑的層次化治療策略，突出了系統闡明中醫藥多組分網絡機制的關鍵需求，尤其是在草藥處方的臨床多樣性背景下。

改良型黃風湯（MHD）由黃芪、僵蠶、蟬蛻、當歸和防風組成，是一種用于健脾補腎的中藥復方。黃芪作為主要成分，具有補氣升陽的作用。從黃芪中已鑒定出100多種化合物。黃芪及其活性成分能有效降低DN小鼠的空腹血糖和蛋白尿水平，逆轉腎小球高濾過狀態，并減輕早期DN小鼠模型的病理變化。僵蠶、蟬蛻和當歸作為輔助藥材，與黃芪協同作用以增強其主要療效。防風可幫助驅除風邪。在傳統中醫中，風邪是指導致身體失衡或疾病的外部因素。防風的主要活性成分包括香豆素、色原酮和多糖。其中，色原酮、prim-o-glucosylcimifugin和5-O-甲基維薩米奧苷具有顯著的藥理活性，包括有效的鎮痛、解熱、抗炎和免疫調節作用，被用作藥材的質量標準。

在傳統中醫醫院的臨床實踐中，MHD在治療多種原發性和繼發性腎臟疾病（包括蛋白尿、IgA腎病和DN）方面表現出顯著的療效。然而，MHD對DN的具體作用機制仍不清楚。新興證據強調了細胞自噬在維持足細胞穩態中的關鍵作用，這一過程由PI3K/AKT/mTOR信號軸嚴格調控。在生理條件下，mTOR復合體1（mTORC1）通過磷酸化ULK1抑制自噬起始，而AKT介導的Bcl-2磷酸化則抑制Beclin-1依賴的自噬體形成。值得注意的是，持續的PI3K/AKT信號通過IRS-1的負反饋加劇胰島素抵抗，而mTOR的過度激活則破壞足細胞自噬流，導致受損細胞器的積累和隨后的腎小球濾過屏障功能障礙。因此，該通路的過度激活與DN的發病機制相關，使其成為恢復足細胞自噬的潛在干預靶點。

本研究探討了MHD對高脂飲食聯合鏈脲佐菌素（STZ）誘導的DN小鼠模型的治療效果，并通過全長16S rRNA測序和代謝組學分析闡明了MHD通過腸道菌群及其代謝物發揮作用的機制。此外，還通過體外實驗進一步探討了MHD及其微生物代謝物對足細胞自噬的影響及其機制。

【結果】

1、MHD活性成分的植物化學分析

通過液相色譜?質譜（LC?MS）分析了MHD的成分，并通過與Waters傳統藥物庫2.0比對，共鑒定出352種成分（見補充材料表S3和S4）。此外，在正負離子模式下，基于準確測定分子量、分析質譜碎片路徑以及與已知對照品的保留時間比對，在LC?MS光譜中確定了10種主要活性成分（圖1A?B）。鑒定結果顯示，MHD的活性成分包括二氫香豆素、升麻苷、5-o-methylvisamminol、formononetin、毛蕊異黃酮、黃耆苷II、亞麻酸乙酯、sec-o-glucosylhamaudol和黃酮（圖1C）。

2、MHD降低血糖水平并改善糖尿病小鼠的胰島素敏感性

小鼠分組如圖2A所示。從第二周開始，高脂飲食（HFD）小鼠的體重顯著增加，隨后在鏈脲佐菌素（STZ）注射后體重下降至低于對照小鼠的水平（圖2B）。此外，經過高劑量MHD（H-MHD）治療后，H-MHD治療組小鼠的體重顯著低于糖尿病腎病（DN）治療組小鼠（p < 0.05），然后緩慢增加，而低劑量MHD（L-MHD）、MHD-D、達格列凈（DSR）和達格列凈（DAPA）單獨使用則對體重無影響（圖2B）。經過6周的H-MHD治療后，DN小鼠的空腹血糖水平顯著降低（p < 0.05）（圖2C）。劑量為1 mg/kg的DAPA對血糖水平無影響（圖2C）。H-MHD（p < 0.01）、MHD-D（p < 0.05）或DAPA（p < 0.05）治療的DN小鼠血清胰島素水平顯著降低（圖2D）。此外，H-MHD和DAPA通過胰島素抵抗的穩態模型評估（HOMA-IR）指數評估，顯著緩解了糖尿病誘導的胰島素抵抗（所有p < 0.05）（圖2E）。Western blot分析顯示，H-MHD（p < 0.05）和MHD-D（p < 0.05）治療增加了DN小鼠肝臟和附睪白色脂肪組織（eWAT）中磷酸化胰島素受體β（IRβ）和AKT的水平（圖2F-G）。H-MHD組在增加胰島素信號傳導方面的總體效果比MHD-D組更為顯著，而單獨使用DSR對胰島素信號傳導的影響較小（圖2F-G）。

3、MHD改善糖尿病小鼠的代謝紊亂

與對照小鼠相比，DN小鼠的肝臟重量顯著增加，而H-MHD治療顯著逆轉了這一變化（p < 0.05）（圖3A）。DN小鼠的血清天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）和丙氨酸氨基轉移酶（ALT）水平顯著升高（p < 0.01），經MHD治療后降低（p < 0.05）（圖3B）。此外，MHD還緩解了與DN相關的高脂血癥，表現為血清甘油三酯（TG）和總膽固醇（TC）水平升高（所有p < 0.05）（圖3C）。MHD-D治療導致血清ALT和TG水平降低（p < 0.05），而單獨使用DSR和DAPA則對這些血清參數無影響（圖3B-C）。組織學分析顯示，DN小鼠的肝臟呈現增加的脂滴沉積和附睪脂肪細胞的肥大，而MHD、MHD-D和DAPA有效緩解了脂滴沉積和附睪脂肪細胞的肥大（圖3D）。相比之下，L-MHD和DSR的效果不明顯（圖3D）。與這些發現一致，H-MHD給藥后，DN小鼠肝臟和eWAT中脂生成基因（如固醇調節元件結合蛋白-1c（Srebp-1c）和乙酰輔酶A羧化酶（Acc））的相對mRNA表達水平顯著降低（所有p < 0.05）（圖3E-F）。相比之下，MHD和MHD-D治療增加了與脂解和脂肪酸氧化相關的標記物（包括激素敏感性脂肪酶（Hsl）、肉堿棕櫚酰轉移酶1α（Cpt-1α）和過氧化物酶體增殖物激活受體α（Pparα））的相對mRNA表達水平（所有p < 0.05）（圖3E-F）。MHD-D和DAPA也對這些脂代謝相關基因在肝臟和eWAT中的表達調控有輕微影響（圖3E-F）。

4、MHD改善糖尿病小鼠的腎損傷

隨后，我們全面研究了MHD對DN小鼠腎臟的保護作用。H-MHD治療有效緩解了DN小鼠血清肌酐（SCR）、血尿素氮（BUN）、尿肌酐（UCR）和尿白蛋白異常升高的水平（p < 0.05），而MHD-D和DAPA治療則適度改善了這些指標（圖4A）。組織學分析清楚地顯示，DN小鼠的腎臟表現出嚴重的腎損傷和間質纖維化，這些變化通過給予H-MHD、MHD-D或DAPA顯著緩解（所有p < 0.01）（圖4B）。相比之下，L-MHD和DSR未能顯著減輕腎損傷（圖4B）。此外，H-MHD、MHD-D和DAPA（所有p < 0.05）強烈抑制了DN小鼠促炎因子和纖維化相關基因的相對mRNA表達（圖4C-D）。這些結果與DN小鼠腎臟中炎癥通路和纖維化信號的減弱密切相關，這通過p65 NF-κB和p38 MAPK的磷酸化水平以及波形蛋白和α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）蛋白的水平得到證實（圖4E）。

5、MHD保護腸道屏障功能并減輕糖尿病小鼠的結腸炎癥

接下來，我們研究了MHD對腸道屏障功能的影響。我們之前的研究已經明確了DAPA對腸道屏障功能和腸道菌群的影響。因此，后續實驗主要關注MHD的影響。DN小鼠的結腸長度比對照小鼠短，而H-MHD和MHD-D治療恢復了這一長度（所有p < 0.01）（圖5A）。此外，H-MHD減輕了DN小鼠結腸組織中的炎性細胞浸潤并增加了粘液分泌（圖5B）。與組織學結果一致，H-MHD和MHD-D上調了結腸中緊密連接相關標記物（即claudin-1、occludin和zonula occludens-1（Zo-1））的mRNA和蛋白水平（所有p < 0.05）（圖5C、E）。另一方面，結腸中炎性細胞因子和趨化因子（如TNF-α和MCP-1）的mRNA表達被下調，而抗炎細胞因子IL-10的表達被H-MHD和MHD-D上調（所有p < 0.05）（圖5D）。相應地，H-MHD和MHD-D治療減輕了結腸中的炎癥通路，表現為p38 MAPK和p65 NF-κB的磷酸化（所有p < 0.05）（圖5E）。單獨給予L-MHD或DSR對腸道屏障功能和結腸炎癥無影響（圖5）。

6、MHD改變糖尿病小鼠腸道菌群的組成和功能

為了探討腸道菌群在MHD改善DN小鼠中的潛在作用，我們對盲腸菌群進行了16S rRNA分析。α多樣性分析顯示，DN小鼠的Chao1指數和Shannon指數顯著低于H-MHD治療小鼠（p < 0.05）（圖6A）。主坐標分析（PCoA）顯示，對照組、DN組和不同藥物治療組之間的β多樣性存在明顯差異，H-MHD治療組的空間位置接近對照組（圖6B）。在門水平上，與對照組相比，DN小鼠中厚壁菌門（Firmicutes）的豐度增加，而疣微菌門（Verrucomicrobia）和變形菌門（Proteobacteria）的豐度降低；然而，這些失衡在MHD治療后得到緩解（圖6C）。隨后基于相對豐度鑒定了前50種細菌，并以熱圖形式展示（圖6D）。H-MHD增加了有益菌（如Akkermansia muciniphila、Desulfovibrio sp011039085和Clostridium cuniculi）的相對豐度，同時減少了有害菌（如Jeotgalibaca ciconiae）的相對豐度（所有p < 0.05）（圖6D-E）。相比之下，MHD-D和DSR未引起顯著影響（圖6D-E）。此外，相關性分析顯示，這四種細菌與腎損傷標志物之間存在強相關性（圖6F）。

7、MHD通過調節腸道菌群代謝物改善糖尿病腎病

為了進一步鑒定可能負責MHD效果的潛在微生物代謝物，我們進行了代謝組學分析。火山圖顯示，與對照組相比，DN組中有168種代謝物顯著增加，293種代謝物顯著減少（圖7A）。H-MHD、MHD-D或DSR治療分別導致69、81和84種代謝物水平增加，以及44、53和78種代謝物水平減少（圖7A）。DN和H-MHD治療共同影響的代謝物的維恩圖進一步顯示了57種代謝物（圖7B）。這些共同代謝物的KEGG通路分析突出了三大主要通路，即谷胱甘肽代謝、精氨酸和脯氨酸代謝以及β-丙氨酸代謝（圖7C）。對這些通路中的代謝物分析顯示，DN小鼠中精脒、亞精胺、L-谷氨酸和γ-氨基丁酸（GABA）的水平顯著降低（所有p < 0.01），而H-MHD治療后這些代謝物的水平顯著增加（所有p < 0.01）（圖7D）。這些代謝物與前50種細菌的相關性分析顯示，精脒和亞精胺與Akkermansia muciniphila、Salmonella enterica、Clostridium cuniculi、Extibacter sp001185345、Desulfovibrio sp011039085和Corynebacterium stationis呈顯著正相關，而與Jeotgalibaca ciconiae呈顯著負相關（圖7E）。此外，精脒與腎損傷標志物的相關性比亞精胺更強（圖7F）。

8、MHD通過激活自噬改善糖尿病小鼠的腎小球損傷

為了進一步明確MHD保護腎功能的機制，我們對糖尿病腎病（DN）小鼠腎臟中的足細胞標記物Wilms’腫瘤1（WT-1）進行了qPCR和Western blot分析。DN小鼠腎臟中WT-1的mRNA和蛋白水平顯著降低，而高劑量MHD（H-MHD）和MHD-D顯著增加了WT-1的表達（所有p < 0.05），低劑量MHD（L-MHD）和達格列凈（DSR）則無此效果（圖8A-B）。腎臟切片的免疫熒光染色顯示，DN組足細胞丟失明顯，而MHD或MHD-D治療（所有p < 0.001）減輕了腎小球損傷（圖8C）。鑒于足細胞自噬在糖尿病腎臟病變中的作用，我們評估了自噬信號。DN小鼠腎臟中自噬相關基因（如Lc3b和Beclin1）的mRNA表達顯著下調（p < 0.05），而H-MHD和MHD-D顯著上調了這些基因的表達（所有p < 0.05）（圖8D）。自噬底物p62則呈現相反的趨勢（圖8D）。這些結果進一步通過LC3B和p62的蛋白水平得到驗證（圖8E）。同樣，L-MHD和DSR對自噬信號無顯著影響（圖8D-E）。

9、MHD和微生物代謝物精脒減輕高糖誘導的MPC5足細胞損傷

為了進一步探討MHD和微生物代謝物精脒在足細胞損傷中的作用，我們采用了高糖（HG）誘導的足細胞損傷體外模型。通過MTT實驗確定了細胞實驗中MHD、MHD-D和DSR的使用濃度（圖S1）。與體內研究結果一致，HG誘導的WT-1表達下調通過qPCR、Western blot和免疫熒光染色評估，顯著被MHD和MHD-D逆轉（所有p < 0.05）（圖9A-C）。精脒處理對WT-1水平的影響（圖9A-C）。此外，MHD（p < 0.01）、MHD-D（p < 0.05）和精脒（p < 0.05）通過下調炎性細胞因子和趨化因子的表達以及減少p38 MAPK和p65 NF-κB的磷酸化，減輕了細胞炎癥（圖9D-E）。單獨使用DSR對足細胞損傷無顯著影響（圖9）。

10、MHD和精脒通過PI3K/AKT/mTOR通路增加足細胞自噬

HG處理導致MPC5細胞中自噬通路相關基因的mRNA和蛋白水平顯著下降，這些變化被MHD、MHD-D和精脒逆轉（所有p < 0.05）（圖10A-B）。此外，雙重免疫熒光染色顯示，經MHD、MHD-D和精脒處理后，足細胞中LC3和溶酶體相關膜蛋白1（LAMP1）的表達增加（所有p < 0.001）（圖10C）。

11、MHD和MHD-D減輕了DN或HG誘導的PI3K/AKT/mTOR通路在DN小鼠腎臟和MPC5細胞中的激活（圖11A-B）。

此外，精脒處理也減弱了這些通路的激活（圖11C-D）。重要的是，當通過PI3K抑制劑LY294002阻斷PI3K/AKT/mTOR信號時，MHD、MHD-D和精脒對自噬的影響被抵消（圖11E-F）。

糖尿病腎病（DN）是糖尿病最嚴重和致命的并發癥之一，可能導致需要透析或腎移植的終末期腎病。目前的治療策略主要集中在癥狀管理上，如控制高血糖、高血壓和蛋白尿，但這些方法不足以阻止DN的進展，使得DN的管理具有挑戰性。越來越多的研究表明，中醫藥（TCM）在DN治療中具有獨特的優勢。在此，我們發現MHD通過不同的機制保護DN小鼠的腎功能。首先，MHD可能通過激活足細胞自噬直接保護腎功能，從而減輕腎臟炎癥和纖維化。其次，MHD導致腸道菌群組成和微生物代謝物（尤其是精脒）的有益變化，而精脒有助于激活足細胞自噬。我們認為，這兩條途徑可能共同促進MHD的治療效果，其中細胞信號介導的直接腎臟效應和腸道菌群調節影響全身代謝和炎癥反應（圖12）。我們的發現為中醫藥管理DN提供了新的見解，并為MHD在未來DN治療中的應用提供了理論依據。

MHD在臨床實踐中已應用三十多年，在各種疾病中顯示出良好的效果。在此，我們發現MHD治療改善了DN小鼠的代謝紊亂、胰島素抵抗和慢性炎癥。重要的是，MHD通過激活足細胞自噬和調節腸道菌群及其相關代謝物，減輕了糖尿病的常見并發癥DN的癥狀。有趣的是，MHD和MHD-D在改善DN方面表現出更顯著的效果，而達格列凈（DSR）的效果則較小。這種差異可能歸因于DSR在配方中的比例極小，僅為2.5%，只能在增加療效方面發揮補充作用，而非直接發揮抗炎和免疫調節功能。此外，在MHD和MHD-D的表型效應中未觀察到統計學上的顯著差異，主要差異在于微生物組成。這一發現可能是因為DSR的主要活性成分prim-o-glucosylcimifugin被認為對修復腸道免疫屏障、調節腸道環境中微生物的豐度以及改善腸道菌群的組成具有顯著的調節作用。然而，我們僅通過LC?MS分析初步鑒定了MHD的活性成分，尚未確定可能有助于MHD在本研究中腎臟保護作用的具體生物活性物質。未來的研究可以利用網絡藥理學技術預測MHD中的關鍵活性成分，并通過分子對接驗證這些預測活性成分對關鍵靶點的結合親和力，以提供更多關于MHD作用和機制的詳細信息。

胰島素抵抗和代謝紊亂是促進DN進展的重要因素。在DN患者中，胰島素抵抗阻礙了血糖的有效攝取和利用，而長期高血糖又會誘導脂質代謝紊亂。我們發現，MHD治療增強了DN小鼠的胰島素信號通路，并改善了肝臟和eWAT中改變的脂質代謝。這一結果可能是因為MHD中黃芪的關鍵活性成分（如黃芪苷II和黃酮）可能增加胰島素與其受體的結合并提高受體活性，從而實現胰島素信號的有效下游傳遞。隨后，AKT磷酸化的調節激活了胰島素信號通路，促進葡萄糖代謝并降低血糖水平。此外，黃芪苷II和黃酮可以促進脂肪酸氧化，抑制脂肪酸在體內的積累，從而調節脂質代謝。黃芪調節糖脂代謝的精確機制尚不清楚。有趣的是，在MHD治療后，ACC和CPT-1α的表達水平顯著降低。因此，我們假設MHD可能通過AMPK/ACC/CPT-1α途徑（一條著名的脂質代謝途徑）發揮作用，這有待進一步研究。

炎癥和纖維化在糖尿病腎損傷的進展中起著關鍵的加速作用。大量研究明確表明，炎癥貫穿于DN的發展過程中，并對導致腎臟損傷至關重要。DN小鼠的腎功能受損，炎性細胞因子（如TNF-α和IL-1β）可以增加TGF-β的表達，進而促進腎臟纖維化的進展。在本研究中，除了減輕肝臟、脂肪組織和結腸的炎癥外，MHD治療還顯著減輕了腎臟的炎癥和纖維化。MHD的這些抗炎和抗纖維化作用可以歸因于其主要活性成分。例如，來自黃芪的黃芪苷II、黃酮、染料木素和毛蕊異黃酮；來自當歸的meranzin hydrate；以及來自DSR的cimicifugoside、5-O-甲基維薩米奧醇和二氫香豆素。這些成分降低了與炎癥和纖維化相關的因子的表達。此外，這些成分可能直接阻礙IκB激酶（IKK）的活性，阻止IκB的磷酸化和隨后的降解，確保NF-κB不會轉移到細胞核以啟動炎性基因的轉錄，從而最終緩解糖尿病引起的腎臟損傷。

腸道?腎臟軸引起了越來越多的關注。在DN患者中，腸道菌群發生了顯著變化，有益菌的豐度減少，有害菌的豐度增加。這種失衡導致緊密連接和粘附蛋白的表達減少，最終導致腸道屏障的破壞。受損的腸道屏障可以促進細胞移位和感染。這一過程反過來通過腸道內毒素和細菌素觸發促炎細胞因子的釋放，從而加劇DN的進展。我們的研究表明，MHD治療保護了腸道屏障并減輕了DN小鼠的結腸炎癥。研究表明，來自黃芪的多糖可以為腸道粘膜的修復提供營養支持，調節腸道粘膜細胞的增殖和凋亡信號，增加粘膜細胞中緊密連接蛋白的表達，最終增強腸道屏障功能。此外，僵蠶、蟬蛻、當歸和DSR等成分可以通過抑制NF-κB通路的活性或調節免疫反應來減輕腸道炎癥。這些生物活性化合物和成分的保護作用可能有助于MHD增強腸道屏障功能。

腸道菌群在DN的進展中起著關鍵作用，我們通過全長16S rRNA分析鑒定了四種與小鼠腎臟損傷指標顯著相關的細菌種類。其中，Akkermansia muciniphila作為一種公認的有益菌，具有最高的豐度，并已被證明可以顯著改善肥胖、1型和2型糖尿病、脂肪肝、腸道炎癥和各種癌癥等狀況。DN小鼠中Akkermansia muciniphila的豐度顯著降低，而在MHD治療后顯著增加，表明MHD的保護作用可能至少部分由這種有益菌介導。盡管文獻中尚未明確定義其他三種細菌的具體作用，但我們的分析顯示，Clostridium cuniculi和Desulfovibrio sp011039085與腎臟損傷指標水平呈負相關，與腸道菌群代謝物精脒和亞精胺呈正相關，而Jeotgalibaca ciconiae則呈現相反的相關模式。因此，我們假設Clostridium cuniculi和Desulfovibrio sp011039085可能作為有益菌，有助于改善DN，而Jeotgalibaca ciconiae豐度的增加可能會加劇腎臟損傷。未來實驗應精心設計以驗證這一假設。我們的結果表明，MHD可能通過DN小鼠的腸道?腎臟軸發揮其作用，但在人類和小鼠之間，腸道菌群的組成和功能以及飲食習慣存在顯著差異。因此，在小鼠模型中有效的治療在人類中可能不一定產生相同的結果，我們的發現不能直接應用于臨床實驗。通過在小鼠中進行額外的菌群移植實驗，可以揭示MHD作用與菌群之間的因果關系。未來的臨床研究可以通過分析接受MHD治療的患者的糞便樣本，驗證這些結果，為這種治療方法的臨床相關性提供更多見解。

通過代謝物分析，我們篩選出四種可能與MHD作用相關的代謝物。具體來說，L-谷氨酸是谷胱甘肽合成的前體，這是一種重要的抗氧化劑，能夠清除體內的自由基和氧化應激產物。因此，L-谷氨酸可能通過增強抗氧化能力來減少氧化應激對腎小管細胞和腎小管間質的損傷，從而改善DN。研究表明，GABA可能通過抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的活性，促進β細胞增殖以改善胰島素抵抗和葡萄糖耐受，并發揮抗炎作用，從而改善DN。大腸桿菌、擬桿菌、梭菌等屬可以參與多胺代謝中的酶促反應，并編碼相關酶以促進多胺（如精脒和亞精胺）之間的轉化。精脒和亞精胺也被認為是自噬激活劑，這些多胺可能通過激活自噬來減輕DN。同樣，我們的體外實驗證實了精脒對足細胞的自噬促進作用。這些結果表明，MHD對DN的治療效果可能與腸道菌群及其相關代謝物的修飾有關。

PI3K/AKT/mTOR信號通路是自噬的重要機制之一。AKT活性受到多種上游信號通路的影響，包括胰島素、胰島素樣生長因子（IGF）、生長因子和細胞外信號。然而，不同受體或通路的激活可能導致不同器官中AKT活性的趨勢相反。這是因為，在肝臟和脂肪組織中，AKT的主要功能是調節糖代謝和脂質合成。AKT活性的降低表明胰島素信號通路被抑制，導致肝臟葡萄糖攝取減少和脂肪細胞中過度積累。相比之下，在腎臟中，DN早期AKT的激活可能發揮保護作用，而長期過度激活AKT可能促進腎臟炎癥和纖維化，從而加速腎衰竭。在我們的研究中，DN小鼠腎臟中AKT與下游mTOR信號通路一同被過度激活，導致自噬受到抑制。MHD本身和微生物代謝物精脒通過抑制PI3K/AKT/mTOR通路激活足細胞自噬，這些效應在PI3K信號被抑制后被抵消，突顯了這一通路在MHD介導的腎臟保護作用中的參與。

除了PI3K/AKT/mTOR通路外，其他通路也可能對MHD的作用和機制有所貢獻。例如，黃芪可以通過AMPK通路降低血糖，毛蕊異黃酮可以通過Nrf2/HO-1通路介導抗氧化反應，而prim-o-glucosylcimifugin可能通過NF-κB通路調節炎癥過程。盡管我們的發現沒有直接證據表明它們的參與，但我們認為未來的研究必須調查這些通路，以更全面地了解MHD的作用機制。

目前DN的治療格局主要分為兩大方法，即中醫藥和西藥。西藥通常依賴SGLT2抑制劑、血管緊張素II受體拮抗劑等藥物來管理DN。然而，這些治療也可能引發嚴重的副作用，如咳嗽、血管性水腫和急性腎損傷。此外，盡管西藥對管理DN至關重要，但通常無法完全阻止疾病的進展。相比之下，中醫藥通過辨證論治和多靶點干預，通過改善患者的癥狀和整體健康狀況提供更全面的方法。目前，臨床上可用的中醫藥處方包括黃連解毒湯、腎氣丸和當歸補血湯。與這些中醫藥相比，MHD作為一種更平衡的草藥組合，具有其自身的優勢，如祛風、清動脈、調節免疫和改善微循環。本研究強調了MHD在治療DN中的獨特優勢，即其對多種機制的多靶點效應，可以通過多種方式保護腎臟并延緩疾病進展。一般來說，MHD是耐受性良好的，由于其主要成分黃芪，可能會出現輕度胃腸道不適或過敏反應等罕見副作用。這些副作用雖然不常見，但突顯了進一步優化治療策略的必要性。將MHD與西藥結合可能可以利用這兩種方法的優勢，從而開發出更有效的DN治療方法。

【結論】

我們的研究揭示了MHD通過減輕胰島素抵抗、改善代謝紊亂，并在DN小鼠中通過減輕炎癥和纖維化發揮腎臟保護作用。這些效應部分是通過保護腸道屏障功能、改變微生物組成及相關代謝物以及激活足細胞自噬來介導的。這些發現為MHD在DN治療中的潛在臨床應用提供了寶貴的見解。

【文章思路】

一、【科學問題】糖尿病腎病（DN）缺乏有效治療手段，而中藥復方MHD臨床有效但機制不明。

【切入點】探究MHD是否通過調節代謝、腸道菌群及自噬通路改善DN。

干預設計：

建立HFD+STZ誘導的DN小鼠模型（模擬人類DN進展）。設置MHD高/低劑量組、MHD-D（去成分組）、陽性藥對照組（達格列凈等），排除非特異性效應。

二、驗證MHD的全身性改善效應（確認MHD對DN核心表型（代謝紊亂、腎損傷）的改善）

1.代謝方面（圖2-3）：

檢測血糖、胰島素抵抗（HOMA-IR）、脂代謝指標（TG/TC）、肝臟/脂肪組織病理及脂代謝基因（Srebp-1c↓, Pparα↑）。

目的：證明MHD改善全身代謝紊亂，為后續聚焦腎臟保護提供基礎。

2.腎臟方面（圖4）：

檢測腎功能指標（SCR/BUN）、腎臟病理（纖維化/炎癥）、相關通路蛋白（p65 NF-κB↓, α-SMA↓）。

目的：直接驗證MHD的腎臟保護作用，銜接后續機制探索。

三、探索“腸-腎軸”機制

【科學假設】腸道菌群失調可能通過代謝物或炎癥加劇DN，MHD可能通過調節腸道功能間接保護腎臟。

實驗設計：

1.腸道屏障與炎癥（圖5）：

檢測結腸長度、粘液分泌、緊密連接蛋白（ZO-1↑）、炎癥因子（TNF-α↓, IL-10↑）。

目的：證明MHD修復腸道屏障功能，減少腸源性毒素入血。

2.菌群組成與功能（圖6）：

16S rRNA測序分析菌群α/β多樣性、有益菌（Akkermansia↑）/有害菌（Jeotgalibaca↓）豐度，并與腎損傷標志物做相關性分析。

目的：建立菌群變化與腎臟保護的直接關聯。

3.代謝組學篩選關鍵代謝物（圖7）：

鑒定差異代謝物（精脒/亞精胺↑），分析其與菌群和腎功能的相關性，鎖定精脒為核心代謝物。

目的：從菌群功能產物中尋找介導MHD效應的物質基礎。

四、分子機制解析（從動物到細胞）

【科學問題】MHD及菌群代謝物如何直接作用于腎臟細胞？

1.體內驗證自噬通路（圖8）：

檢測足細胞標記物（WT-1↑）、自噬相關基因（LC3B↑, p62↓），確認MHD激活足細胞自噬。

2.體外模型驗證（圖9-10）：

高糖誘導足細胞損傷模型，加入MHD或精脒，觀察WT-1恢復、炎癥通路抑制及自噬激活。

目的：排除全身干擾，直接證明MHD和代謝物對足細胞的保護作用。

3.通路阻斷實驗（圖11）：

使用PI3K抑制劑（LY294002）阻斷PI3K/AKT/mTOR通路，逆轉MHD和精脒的自噬激活效應。

目的：確認該通路為MHD作用的關鍵靶點。

【邏輯思路總結】

1、MHD多組分（如黃酮類）→ 改善全身代謝（降血糖、調脂）→ 減輕腎臟代謝負擔。

2、MHD修復腸道屏障→ 調節菌群（增加Akkermansia等）→ 產生精脒等代謝物→ 入血后激活足細胞PI3K/AKT/mTOR通路→ 促進自噬→ 抑制炎癥/纖維化→ 保護腎功能。

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