云南白藥是我國具有自主知識產(chǎn)權(quán)的中藥大品種，藥用歷史已有百余年。云南白藥具有活血化瘀等作用，常用于治療跌打損傷，臨床療效確切。2013年，香港衛(wèi)生署發(fā)布新聞公報(bào)，因云南白藥中含有未標(biāo)示烏頭類生物堿成分，指令藥物進(jìn)口商豐華（香港）公司回收云南白藥散劑等5款云南白藥中成藥。草烏Aconiti Kusnezoffii Radix是云南白藥不可或缺的主要藥材，盡管在有效劑量及治療周期內(nèi)臨床上未顯示不良反應(yīng)，但由于草烏含有烏頭堿等有毒生物堿，云南白藥被國際所排斥，嚴(yán)重地影響其有效利用及國際發(fā)展。

草烏為毛茛科植物北烏頭Aconitum kusnezoffiiReichb.的干燥塊根，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》。歷代醫(yī)家及本草著作稱草烏“有毒”，需炮制或與其他中草藥配伍后方可供內(nèi)服使用。現(xiàn)代研究表明，人服用生草烏3～4.5 g可出現(xiàn)毒性反應(yīng)，草烏對小鼠的半數(shù)致死量（ip）生用為0.19 g/kg，而炮制后則為6～10 g/kg。烏頭類雙酯型二萜生物堿既是草烏引起中毒的主要毒性物質(zhì)，同時(shí)也是其主要的生理活性物質(zhì)，已有草烏甲素[1-2]等作為藥品應(yīng)用于臨床治療疾病。研究表明，烏頭堿類成分具有強(qiáng)心[3-4]、鎮(zhèn)痛[5]、活血[6]、抗炎[7]、抗抑郁[8-9]、抗腫瘤[10-11]、抗氧化[12]、抗病毒[13]等藥理作用。

從古至今，草烏的毒性眾所周知，但由于其具有良好的活血化瘀功效，且藥用價(jià)值高，在臨床仍有較高的使用頻率。科學(xué)評價(jià)草烏在云南白藥配伍中的作用，揭示配伍環(huán)境下草烏發(fā)揮作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，對充分發(fā)揮云南白藥療效、提高國際市場的份額具有十分重要的意義。本研究采用sc鹽酸腎上腺素的方法復(fù)制血瘀證大鼠模型，利用方證代謝組學(xué)研究策略評價(jià)云南白藥的活血化瘀作用，闡明血瘀證血液潛在生物標(biāo)記物及云南白藥調(diào)節(jié)的代謝經(jīng)路，進(jìn)一步表征與血液潛在生物標(biāo)記物高度關(guān)聯(lián)的血中移行成分，最終闡釋云南白藥配伍環(huán)境中草烏活血化瘀作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

1材料

1.1動物

SPF級雄性SD大鼠，9周齡，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全性評價(jià)中心提供，合格證號SCXK（遼）2015-0001。大鼠在SPF環(huán)境中飼養(yǎng)，環(huán)境溫度（25±1）℃，相對濕度（50±5）%，12 h光/暗周期交替，自由進(jìn)食飲水。動物實(shí)驗(yàn)經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號2019011501）。

1.2藥品與試劑

云南白藥（批號ZFA1621）由云南白藥股份集團(tuán)有限公司提供，按《中國藥典》2020年版檢驗(yàn)，結(jié)果符合規(guī)定；鹽酸腎上腺素注射液（批號H12020526）購自天津金耀藥業(yè)有限公司；氯化鈉注射液（批號180923D7）購自哈爾濱三聯(lián)藥業(yè)有限公司；甲醇（色譜級，批號192934）購自德國Merck公司；乙腈（色譜級，批號194036）購自美國賽默飛世爾科技公司；甲酸（色譜級，批號193682）購自天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；其他試劑均為分析純。

1.3儀器

Waters AcquityTM UPLC液相色譜儀、Waters Synapt G2-Si質(zhì)譜分析系統(tǒng)（美國Waters公司）；Z30型全自動血流變測試儀（南京志倫科技有限公司）；KDC-160HR型高速低溫離心機(jī)（科大創(chuàng)新股份公司）；AG135型分析天平（瑞士METTLER公司）；RVC 2-18 CD plus真空離心濃縮儀（德國Christ公司）；900系列超低溫冰箱（美國Thermo Fisher Scientific公司）。

2方法

2.1給藥溶液的制備

取鹽酸腎上腺素注射液，用生理鹽水稀釋為0.18 mg/mL的溶液；精密稱取云南白藥10.29 g，加入0.5%羧甲基纖維素鈉溶液500 mL，配制成質(zhì)量濃度為20.58 mg/mL的溶液。

2.2分組、造模與給藥

33只SD大鼠隨機(jī)分為對照組、模型組和云南白藥（180 mg/kg，相當(dāng)于人體等效劑量）組，每組11只。除對照組外，其余大鼠sc鹽酸腎上腺素（0.3 mg/kg），1次/d，連續(xù)7 d，制備血瘀證模型。給藥組于第8天ig云南白藥給藥溶液，對照組ig等體積生理鹽水，1次/d，連續(xù)給藥15 d。

2.3樣品采集

于實(shí)驗(yàn)第7天，腹主動脈采集對照組和模型組大鼠血液，于給藥第15天采集云南白藥組大鼠血液。采集血液（肝素鈉抗凝血）1 mL用于全血黏度檢測；血液于4 ℃、4 000 r/min離心15 min后，取血漿（肝素鈉抗凝血）1 mL用于血漿黏度檢測，取血漿（檸檬酸鈉抗凝血）2 mL用于血漿凝血酶原時(shí)間、血漿凝血酶時(shí)間、纖維蛋白原檢測。另采集血液3 mL，靜置30 min，4 ℃、4 000 r/min離心15 min，取血清100 μL用于代謝組學(xué)分析。采集大鼠血液后，分別摘取大鼠心臟、肝臟、脾臟、肺臟及腎臟，生理鹽水沖洗，濾紙擦拭干凈表面水分后，稱定質(zhì)量，計(jì)算臟器指數(shù)，于10%中性甲醛中固定用于病理學(xué)檢測[14]。

臟器指數(shù)＝臟器質(zhì)量/體質(zhì)量

2.4血清代謝組學(xué)分析

2.4.1樣品制備 取大鼠血清100 μL，加入400 μL甲醇，混懸振蕩60 s后，4 ℃、13 000 r/min離心15 min，于真空離心濃縮儀濃縮，用100 μL 50%甲醇復(fù)溶，混懸振蕩60 s，4 ℃、13 000 r/min離心15 min，取上清液供液質(zhì)分析。

2.4.2分析條件 使用Waters AcquityTM UPLC液相色譜儀串聯(lián)Waters Synapt G2-Si質(zhì)譜分析系統(tǒng)進(jìn)行血清代謝組學(xué)分析。

（1）色譜條件：采用Waters Acquity UPLCTM HSS T3色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），柱溫35 ℃，體積流量0.4 mL/min，進(jìn)樣體積2 μL。流動相A為0.1%甲酸乙腈溶液，B為0.1%甲酸水溶液，梯度洗脫：0～2.0 min，1%～30% A；2.0～3.0 min，30%～40% A；3.0～4.0 min，40%～50% A；4.0～5.0 min，50%～60% A；5.0～6.0 min，60%～65% A；6.0～7.0 min，65%～70% A；7.0～10.0 min，70%～99% A。

（2）質(zhì)譜條件：毛細(xì)管電壓分別為3.0 kV（正離子）、2.5 kV（負(fù)離子）；錐孔電壓分別為30 V（正離子）、20 V（負(fù)離子）；去溶劑氣溫度為350 ℃（正、負(fù)離子）；去溶劑氣體積流量為800 L/h（正、負(fù)離子）；離子源溫度為110 ℃（正、負(fù)離子）；采用亮氨酸腦啡肽（[M＋H]+ m/z 556.277 1、[M－H]? m/z 554.261 5）進(jìn)行質(zhì)量校正，校正溶液體積流量為10 μL/min，校正頻率為0.2 s；色譜儀流出液不經(jīng)分流直接注入質(zhì)譜儀進(jìn)行正、負(fù)離子全掃描分析，掃描范圍m/z 50～1 200。

2.4.3數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)采用Progenesis QI軟件進(jìn)行分析，得到的數(shù)據(jù)矩陣應(yīng)用EZinfo 3.0軟件進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘法-判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA），同時(shí)結(jié)合投影變量重要性（variable importance for the projection，VIP）值（VIP＞1）及組間t檢驗(yàn)（P＜0.05）結(jié)果，篩選關(guān)鍵性的代謝產(chǎn)物。Mass FragmentTM應(yīng)用管理器用于表征MS/MS碎片離子分析過程，在Metlin、HMDB和Chemispider數(shù)據(jù)庫的基礎(chǔ)上，利用MetPA軟件對潛在的生物標(biāo)志物進(jìn)行重建、相互作用和路徑分析，以分析生物標(biāo)記物和確定代謝途徑。

采用PCMS軟件進(jìn)行血中移行成分及血清代謝產(chǎn)物關(guān)聯(lián)性分析，設(shè)置0.5≤|r|≤0.7為高度正（負(fù)）相關(guān)，0.7≤|r|≤1為極度正（負(fù)）相關(guān)；選擇與血清代謝產(chǎn)物高度相關(guān)個(gè)數(shù)在5個(gè)及以上的血中移行成分，作為云南白藥配伍環(huán)境中草烏活血化瘀作用的潛在藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以 表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

3結(jié)果

3.1云南白藥治療血瘀證大鼠的療效評價(jià)

3.1.1經(jīng)典血液流變學(xué)及組織病理學(xué)評價(jià) 應(yīng)用經(jīng)典血液流變學(xué)及組織病理學(xué)評價(jià)云南白藥治療血瘀證大鼠的療效，發(fā)現(xiàn)與對照組比較，模型組大鼠全血黏度及血漿黏度升高，凝血酶時(shí)間、凝血酶原時(shí)間縮短，血漿纖維蛋白原含量升高；模型組大鼠的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟均出現(xiàn)不同程度的血管擴(kuò)張、充血、瘀血、水腫及炎細(xì)胞浸潤等血瘀證的病理變化，其中以心臟及脾臟的改變最為顯著。給予云南白藥治療15 d后，大鼠全血黏度及血漿黏度降低，血漿凝血酶時(shí)間、血漿凝血酶原時(shí)間均延長；各臟器瘀血、充血、水腫及炎細(xì)胞浸潤等病理現(xiàn)象大部分消失，形態(tài)結(jié)構(gòu)恢復(fù)完整、清晰，接近對照組大鼠，且云南白藥對心臟、肝臟及腎臟瘀血的改善效果較好[14]。

3.1.2臟器指數(shù)評價(jià) 如圖1所示，與對照組比較，模型組大鼠心臟、肝臟、脾臟、肺臟指數(shù)稍有下降，腎臟指數(shù)稍有升高；給予云南白藥治療后，大鼠心臟、脾臟、腎臟指數(shù)升高，肝臟、肺臟指數(shù)降低，組間比較差異無顯著性。

3.2云南白藥治療血瘀證的血清代謝組學(xué)研究

采用優(yōu)化的色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法，將采集得到的對照組、模型組及云南白藥組大鼠血清代謝輪廓數(shù)據(jù)（圖2-A）輸入Progenesis QI軟件，各色譜峰經(jīng)過匹配、提取、標(biāo)準(zhǔn)化流程后，將離子歸一化，進(jìn)行非監(jiān)督型PCA，得到能反映組間變化趨勢的得分圖（圖2-B、C），可見模型組、對照組及云南白藥組聚類明顯，組間分離。

根據(jù)關(guān)鍵性代謝產(chǎn)物的保留時(shí)間及精確相對分子質(zhì)量，利用元素組成分析（分辨率＞10 000，精密度＜5×10?6），確定可能的化學(xué)式；以精確相對分子質(zhì)量、可能的化學(xué)式及二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)為線索，檢索HMDB數(shù)據(jù)庫（http://www.hmdb.ca）等代謝產(chǎn)物和質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行質(zhì)譜信息匹配，初步推測代謝產(chǎn)物的可能歸屬；進(jìn)一步將匹配所得化合物及相應(yīng)二級質(zhì)譜信息輸入Masslynx嵌套的Massfragment軟件，根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)裂解的可能性及生物質(zhì)譜裂解規(guī)律，驗(yàn)證鑒定的有效性。如表1所示，從模型組大鼠血清樣本中篩選出了包括賴氨酸、白三烯A4等在內(nèi)的34個(gè)潛在生物標(biāo)記物，其中正離子模式下13個(gè)、負(fù)離子模式下21個(gè)。經(jīng)云南白藥治療15 d后，能回調(diào)血瘀證的23個(gè)潛在生物標(biāo)記物，包括尿刊酸、焦谷氨酸等，其中13個(gè)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05、0.01，圖2-D）。將云南白藥能回調(diào)的23個(gè)血瘀證血清潛在生物標(biāo)記物進(jìn)行MetPA分析，發(fā)現(xiàn)組氨酸代謝、鞘脂代謝、谷胱甘肽代謝、卟啉和葉綠素代謝、花生四烯酸代謝及纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解為云南白藥治療血瘀證的關(guān)鍵代謝通路（圖3）。

3.3云南白藥配伍環(huán)境中草烏生物堿類血中移行成分與代謝標(biāo)記物相關(guān)性研究

采用PCMS軟件進(jìn)行分析，分別計(jì)算云南白藥配伍環(huán)境下草烏7個(gè)血中移行成分[15]與云南白藥調(diào)節(jié)的23個(gè)血瘀證血清潛在生物標(biāo)記物的Pearson相關(guān)系數(shù)，得到關(guān)聯(lián)分析熱圖（圖4），發(fā)現(xiàn)與5個(gè)及以上血清潛在生物標(biāo)記物高度相關(guān)的血中移行成分為森布星B、異塔拉定、塔拉烏頭胺及展花烏頭寧。

4討論

中藥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究是解讀中藥有效性及安全性等問題的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，然而，由于中藥方劑給藥形式的特殊性及方證對應(yīng)療效的專屬性，決定了中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究的復(fù)雜性。以往關(guān)于中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究已形成了許多行之有效的研究方法，如高通量活性篩選技術(shù)[16]、基于藥效基團(tuán)的虛擬篩選及分子對接技術(shù)[17-18]、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)[19]等，在解決中藥活性成分確認(rèn)方面起到積極的促進(jìn)作用。然而由于思路、方法及應(yīng)用技術(shù)的局限，都在某些方面存在不可逾越的弊端，并不能使發(fā)現(xiàn)的所謂活性成分與中藥的臨床有效性直接相關(guān)聯(lián)，致使實(shí)質(zhì)性的中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究寥寥無幾，中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究方法進(jìn)展緩慢。方證代謝組學(xué)是利用代謝組學(xué)技術(shù)表征證候生物標(biāo)記物及精準(zhǔn)評價(jià)方劑效應(yīng)，利用中藥血清藥物化學(xué)方法鑒定方劑表達(dá)療效的體內(nèi)顯效成分，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)并確認(rèn)與生物標(biāo)記物高度關(guān)聯(lián)的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，從而闡明方劑效應(yīng)成分及效應(yīng)機(jī)制，解決中藥有效性相關(guān)科學(xué)問題的系統(tǒng)科學(xué)[20-26]，為中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供了新途徑。

本研究應(yīng)用方證代謝組學(xué)研究策略，在前期研究確證云南白藥治療大鼠血瘀證的有效性的基礎(chǔ)上，首先應(yīng)用代謝組學(xué)技術(shù)表征了血瘀證的34個(gè)血清潛在生物標(biāo)記物、云南白藥調(diào)節(jié)的23個(gè)血瘀證生物標(biāo)記物及包括組氨酸代謝、花生四烯酸代謝、鞘脂代謝等在內(nèi)的相關(guān)代謝通路。4-咪唑啉酮-5-丙酸、尿刊酸與組氨酸代謝密切相關(guān)。在肝臟中，尿刊酸由尿刊酸水合酶轉(zhuǎn)化為咪唑-4-酮-5-丙酸，而4-咪唑酮-5-丙酸可以自發(fā)地衰變成4-氧戊二酸酰胺或甲酰基谷氨酰胺，并最終轉(zhuǎn)化為谷氨酸[27]。尿刊酸是皮膚中的主要光線受體，以反式尿刊酸存在，經(jīng)紫外線照射后轉(zhuǎn)變?yōu)轫樖侥蚩帷Ｑ芯匡@示，血瘀型銀屑病患者存在顯著的代謝紊亂，特別是血脂代謝異常[28]。銀屑病患者照射治療后順式尿刊酸含量增加，同時(shí)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞活性明顯降低，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)尿刊酸降低細(xì)胞活性具有劑量相關(guān)性[29]。白三烯A4、前列腺素I2（prostaglandin I2，PGI2）、前列腺素B2（prostaglandin B2，PGB2）及血栓素B2（thromboxane B2，TXB2）與花生四烯酸代謝密切相關(guān)。PGI2是一種強(qiáng)大的血管擴(kuò)張劑，可抑制血小板黏附與聚集，防止在初級止血（血液凝塊形成的一部分）中涉及的血小板栓塞的形成[30]。PGB2是PGJ2前列腺素類的代謝產(chǎn)物。TXB2在血小板釋放反應(yīng)中很重要，具有強(qiáng)烈的收縮血管、促進(jìn)血小板聚集以及導(dǎo)致血栓形成等作用，跟蹤檢測TXB2含量可直觀反映體內(nèi)瘀血情況[31]。研究發(fā)現(xiàn)臨床氣虛血瘀證患者血液中TXB2含量升高[32]。TXB2作為血栓素A2（thromboxane A2，TXA2）的降解產(chǎn)物，常被用于標(biāo)志TXA2的產(chǎn)生水平和TXA2相關(guān)酶的活性[33]。研究證實(shí)以TXA2升高為主的TXA2/PGI2失衡是血瘀證的一個(gè)重要指標(biāo)[34-35]。LysoPE[20∶5(5Z,8Z, 11Z,14Z,17Z)/0∶0]與LysoPE[20∶1(11Z)/0∶0]是溶血磷脂，與鞘脂代謝密切相關(guān)。溶血磷脂服務(wù)于重要的信號傳導(dǎo)如溶血磷脂酸（lysophosphatidic acids，LPA）。LPA主要產(chǎn)生于血栓形成過程中被激活的血小板，可通過G蛋白偶聯(lián)受體引起多種生物學(xué)效應(yīng)[36]；LPA能夠引起正常內(nèi)皮的遷移，在傷口愈合、潰瘍愈合以及血管再生中均發(fā)揮重要作用；此外，LPA也具有引起平滑肌收縮、血小板聚集的功能[37]。

進(jìn)一步應(yīng)用PCMS關(guān)聯(lián)分析，得到與血清潛在生物標(biāo)記物高度相關(guān)的4個(gè)血中移行成分，判定為云南白藥配伍環(huán)境中草烏活血化瘀的潛在藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。本研究表征出的4個(gè)潛在藥效物質(zhì)基礎(chǔ)成分均為胺醇型C19-二萜生物堿。研究表明，胺醇型C19-二萜生物堿對離體牛蛙心肌細(xì)胞損傷、大鼠心肌缺血再灌注損傷有保護(hù)作用，對多種動物模型具有改善肌力作用和左室舒張功能等活性；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)異塔拉定等醇胺型二帖生物堿是強(qiáng)心的活性成分。“心主血脈”，心臟的搏動可使血液在脈道中順暢的運(yùn)行，一旦心臟功能受損，血液運(yùn)行不通暢則易形成“血瘀”[38]。

本研究采用方證代謝組學(xué)理論方法，建立云南白藥配伍環(huán)境中草烏藥效生物評價(jià)體系，提取與血瘀證標(biāo)記物軌跡變化高度關(guān)聯(lián)的草烏生物堿類成分，明確云南白藥配伍環(huán)境中草烏活血化瘀作用的藥效成分為森布星B、異塔拉定、塔拉烏頭胺及展花烏頭寧。本研究首次報(bào)道了云南白藥中草烏生物堿類顯效成分，在保證有效性和配伍的前提下，存在于可追溯藥材中；從化學(xué)成分層面解釋了云南白藥臨床使用劑量及組方的合理性，為提高云南白藥的國際化進(jìn)程和認(rèn)可度提供了依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

參考文獻(xiàn)（略）

來 源：韓 瑩，董 輝，孫 暉，張清宇，陳 驁，楊 樂，王喜軍．基于方證代謝組學(xué)的云南白藥配伍環(huán)境中草烏活血化瘀作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究[J]. 中草藥, 2025, 56(8): 2678-2686

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