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遺傳性聽力損失約占先天性耳聾的60%。盡管腺相關病毒（AAV）介導的基因治療在治療遺傳性聽力障礙方面展現了巨大的潛力，但關于AAV載體的特異性和安全性仍存在問題。耳蝸的復雜結構進一步增加了精準靶向基因遞送的難度。

基于此，2025年4月21日，上海科技大學鐘桂生研究團隊在Neuron雜志發表了“Deciphering enhancers of hearing loss genes for efficient and targeted gene therapy of hereditary deafness”揭示了解讀聽力損失基因的增強子以實現高效、靶向的遺傳性耳聾基因治療。

在此研究中，作者引入了一種基于AAV報告基因的體內轉錄增強子重建（ARBITER）工作流程，從而實現對增強子高效解析。通過ARBITER成功證明了基因組中的保守非編碼DNA元件（CNEs）協同調控Slc26a5基因的表達，并通過敲除小鼠模型進一步驗證了這一發現。還通過在Slc26a5突變小鼠中進行基因治療，評估了所鑒定增強子在治療遺傳性聽力損失中的潛力。基于原有Slc26a5增強子效率有限的問題，作者設計了一個高效且特異性針對外毛細胞（OHC）的增強子B8，該增強子成功恢復了Slc26a5敲除小鼠的聽力。

圖一 ARBITER的概念與工作流程

ARBITER工作流程的核心概念是利用AAV-ie載體，這種載體能夠高效感染多種類型的內耳細胞從而將包含合成基因調控元件的報告基因遞送到耳蝸中。通過分析ATAC-seq和ChIP-seq數據集識別開放染色質序列和轉錄因子結合位點，并選擇位于轉錄起始位點上下游200kb內的潛在調控元件。這些元件被插入報告基因質粒并通過AAV-ie載體遞送到新生小鼠耳蝸中，注射后1-2周評估其在毛細胞和支持細胞中的特異性、效率和強度。以Atoh1基因為例，使用三個已知增強子（E1-E3）生成七個報告基因構建體，發現E2和E3組合顯示出最佳的毛細胞靶向效率和特異性，而添加E1反而降低了效率。這些增強子還能在前庭毛細胞中誘導特異性表達。研究表明，ARBITER方法可靠且高效，適用于解析耳蝸基因的調控元件，為理解耳蝸發育及功能提供了新的技術手段，有助于聽力損失等疾病的治療研究。

圖二 Slc26a5-E1+E2雙敲除小鼠的表型特征分析

為了驗證CNEs在調控基因表達中的功能，作者嘗試通過敲除小鼠模型來驗證所鑒定的Slc26a5增強子的功能。利用CRISPR-Cas9基因編輯技術，成功構建了Slc26a5-E1敲除小鼠（Slc26a5-E1?/?E2+/+）和Slc26a5-E1+E2雙敲除小鼠（Slc26a5-E1?/?E2?/?），并對其表型進行了分析。從P6開始監測prestin的表達（此時OHCs中開始表達prestin），并通過免疫熒光染色進行檢測。在Slc26a5-E1敲除小鼠模型中，P6和P16時，無論是雜合還是純合敲除Slc26a5-E1，prestin在耳蝸頂端、中部和基底區域的表達均未受到影響。然而，在P30時，純合敲除Slc26a5-E1的小鼠在中部和基底區域的prestin水平顯著降低，而雜合敲除則導致prestin水平較野生型小鼠有中度下降。這些觀察結果表明，在Slc26a5-E1缺失后，隨著耳蝸成熟，prestin表達逐漸減少，尤其是在基底和中部區域。掃描電子顯微鏡成像顯示，P30時Slc26a5-E1缺失并未影響OHC的形態。隨后，在P16、P30和P90進行聽覺腦干反應（ABR）和畸變產物耳聲發射（DPOAE）測試表明，純合敲除Slc26a5-E1的小鼠ABR和DPOAE閾值隨成熟逐漸升高，且高頻到低頻的變化尤為明顯，表明漸進性聽力損失的發生。這些發現揭示了Slc26a5-E1在調控prestin表達中的關鍵作用。接下來，作者評估了Slc26a5-E1+E2雙敲除小鼠中prestin的表達。純合敲除Slc26a5-E1+E2完全消除了prestin的表達，突顯了Slc26a5-E1和E2在調控prestin表達中的重要作用。P30時的SEM成像顯示，純合敲除Slc26a5-E1+E2導致顯著的OHC損傷，表現為頂端、中部和基底區域明顯的OHC丟失。與此一致，ABR和DPOAE測試表明，純合敲除Slc26a5-E1+E2導致ABR閾值顯著升高以及DPOAE完全消失。這些結果進一步揭示了兩個增強子元件協同作用對確保目標基因穩定表達的重要性。

圖三 高效且特異性針對OHC的增強子設計

體內評估顯示，由更保守模塊或關鍵模塊生成的合成增強子B5（E1P3+E2P2）和B6（E1P3+E2P3）能夠特異性轉導OHCs。相反，由保守性較低的元件組合而成的B1（E1P1+E2P1）、B2（E1P1+E2P4）、B3（E1P2+E2P1）和B4（E1P2+E2P4）未能誘導OHC特異性的報告基因表達。更重要的是，B7（E1P3+E2P2+E2P3），即通過依次結合來自E1的一個關鍵模塊和來自E2的兩個關鍵模塊生成的增強子，其轉導效率比僅由E1P3和E2的單一關鍵元件組成的B5和B6更高。這些結果表明，較小的關鍵保守模塊對于協同驅動小鼠OHC中的基因表達十分必要。基于這一模式，進一步通過復制和組合關鍵模塊設計了兩個合成增強子，分別命名為B8和B9。B8（E1P3×2+E2P2×2+E2P3×2）通過依次組合雙倍E1P3、雙倍E2P2和雙倍E2P3生成，而B9（(E1P3+E2P2+E2P3)×2）則是通過復制B7生成，而不考慮原始Slc26a5-E1+E2的方向性。體內評估表明，B8模擬了原始E1+E2增強子的方向性，在OHC中表現出顯著優于E1+E2或B7的基因表達水平。B8顯示出顯著提高的效率，在頂端、中部和基底區域實現了幾乎100%的OHC轉導。此外，B8介導的基因表達水平也顯著增強。對耳蝸橫截面和前庭組織的進一步成像分析證實，B8是一種高度特異性靶向外毛細胞的增強子。此外，B8并未引起大腦、心臟或肝臟的脫靶感染。作者還評估了B8在基因遞送中的安全性。聽覺功能測試表明，B8增強子在OHC特異性基因遞送中是安全的。

圖四 利用B8增強子在成年小鼠中實現OHC的安全且特異性轉導

人類新生兒的內耳已完全發育，而小鼠耳蝸從新生階段到成年階段會經歷結構和功能的變化。為評估B8增強子在潛在臨床應用中的可行性，作者研究了B8在成年小鼠中OHC的轉導能力。AAV報告基因在P30時被遞送到耳蝸中，并在10天后進行功能和成像測試。熒光成像顯示，與同時轉導OHC和內毛細胞（IHC）的CAG啟動子相比，B8能誘導OHC特異性的基因表達。此外，B8并未導致前庭細胞的脫靶轉導。聽覺腦干反應（ABR）測試表明，在16kHz下，對照組小鼠與注射AAV2-B8-nls-mNeonGreen的小鼠之間的ABR閾值相當，但注射AAV2-CAG-nls-mNeonGreen的小鼠表現出升高的閾值，這可能是由于CAG啟動子介導的nls-mNeonGreen在IHC中強表達引起的毒性作用。此外，CAG而非B8介導的遞送導致波I振幅降低和潛伏期延長。最后，不同頻率下的ABR測試表明，對照組小鼠與注射AAV2-B8-nls-mNeonGreen的小鼠之間具有相似的閾值。這些結果表明，B8在成年小鼠中能夠安全且高效地實現OHC特異性基因遞送。

圖五 全文摘要圖

總結

該研究建立了ARBITER工作流程，用于解析聽力損失基因的增強子。利用ARBITER，研究人員解碼了Slc26a5基因的增強子并設計了一個高效且特異于OHC的增強子。通過基因治療使用該增強子，成功恢復了Slc26a5基因敲除小鼠的聽覺功能。

文章來源

https://doi.org/10.1016/j.neuron.2025.03.023