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Introduction

炎癥性腸病（IBD）是一種復發性和慢性胃腸道炎癥性疾病，包括潰瘍性結腸炎和克羅恩病。在過去的半個世紀里，IBD在世界范圍內普遍存在。臨床和臨床前研究結果表明，靶向腸道微生物群及其代謝物在預防和治療結腸炎中起著關鍵作用。產乳酸菌的消失與結腸炎的惡化有關。研究表明，乳酸是產乳酸菌代謝與宿主細胞上的受體相互作用以維持宿主健康的關鍵副產品。代謝物的豐度和微生物組的組成受飲食因素的調節。增加富含益生元的天然產品的消費可能有助于通過維持腸道健康來預防和緩解炎癥性疾病。雖然確切的機制尚不清楚，但益生元和微生物群之間的相互作用與有益效果有關。

大豆多糖（SP）是一種膳食纖維，通常用作功能性食品添加劑。商業SP通常從豆渣中提取，豆渣是豆腐和豆漿生產過程中產生的一種豐富且廉價的副產品。SP主要由半乳糖醛酸、鼠李糖、半乳糖和木糖組成，分子量5×103～1×106 Da不等。對SP的研究伴隨著對其生物活性的興趣增加，例如免疫調節活性、抗氧化活性、抗肥胖活性、修復輻射損傷。最近的一項體外研究表明，SP對腸道微生物的組成具有有益的調節作用。然而，SP是否對結腸炎有保護作用及其潛在的分子機制尚不清楚。

因此，在本研究中研究了SP對葡聚糖硫酸鈉（DSS）誘導的小鼠結腸炎模型的緩解作用。確定隱窩損傷和杯狀細胞數量以測試腸道屏障的完整性。考慮到SP影響腸道微生物群，探索了SP調節腸道微生物組成和微生物群衍生代謝物的能力，這與影響腸道干細胞的增殖有關。因此，本研究結果旨在為SP在結腸炎預防中的潛在應用提供新的思路。

Results and Discussion

膳食SP減輕DSS誘導的實驗性結腸炎

為了研究SP對腸道功能的影響，利用DSS誘導的結腸炎模型。如上所述，給予小鼠蒸餾水或SP（400 mg/kg）。第25天，用飲用水中的2% DSS處理小鼠以誘導急性結腸炎，并在5 d后實施安樂死（圖1A）。評估了SP對DSS治療期間結腸炎相關癥狀以及體質量變化的影響。與DSS組相比，補充SP保護動物免受DSS誘導的體質量減輕（圖1B）。SP顯著抑制了疾病活動指數評分（DAI，與體質量減輕、大便稠度和直腸出血有關的綜合評分）的增加（圖1C）。補充SP導致結腸炎改善，結腸延長增加明顯（圖1D和E）。此外，SP喂養小鼠的脾臟腫大得到改善（圖1F和G）。盲腸重量不受SP處理的顯著影響（圖1H）。與DSS處理的小鼠相比，反映中性粒細胞浸潤的SP處理小鼠結腸中的MPO活性降低（圖1I）。綜上所述，這些結果表明SP在結腸炎動物模型中具有保護作用。

圖1膳食SP減輕了DSS誘導的實驗性結腸炎

SP改變了免疫細胞譜和巨噬細胞極化以減輕炎癥環境

炎性細胞因子和免疫細胞的異常激活是結腸炎發生和發作的關鍵因素。為了揭示SP對全身和腸道炎癥反應的保護作用，評估了血漿和結腸中的促炎細胞因子水平。SP喂養顯著降低了DSS處理小鼠血漿中白細胞介素IL-1β、IL-6和腫瘤壞死因子TNF-α的循環水平（圖2A-C）。同樣，DSS暴露導致結腸炎癥標志物IL-1β、IL-6和TNF-α顯著升高，而SP預處理成功地減少了結腸組織中促炎細胞因子的分泌（圖2D-F）。除了抑制M1巨噬細胞產生的促炎細胞因子的分泌外，SP處理后M1巨噬細胞標志物Cd86、誘導型一氧化氮合酶（iNOS）和單核細胞化學引誘蛋白-1（MCP-1）的轉錄也顯著降低（圖2G-I）。此外，在SP補充小鼠的結腸中，炎癥區1（Fizz1）中發現的M2標記物Cd206、精氨酸酶1（Arg1）的產生也上調（圖2J-L）。還觀察到DSS組結腸組織中Cd11b的顯著增加，而SP處理抑制了Cd11b的表達（圖2M）。同樣，SP小鼠的Cd45和Cd3的mRNA水平下調（圖2M）。此外，SP補充小鼠抗炎因子、轉化生長因子(Tgf)-β和IL-10 mRNA表達上調（圖2N）。綜上所述，SP可抑制DSS誘導的巨噬細胞向促炎型巨噬細胞分化，維持結腸微環境的促炎與抗炎平衡。

圖2 SP改變了免疫細胞譜和巨噬細胞極化以減輕炎癥環境

SP預處理可防止結腸上皮損傷

腸道屏障缺陷是結腸炎的主要病理特征，導致細菌抗原或細菌滲漏。接下來，將重點關注結腸屏障完整性，以更好地了解SP對屏障功能的影響。組織學分析顯示，SP減輕了結腸中的隱窩損傷、炎性細胞浸潤和總體組織學評分（圖3A-C）。正如預期的那樣，觀察到SP預處理明顯降低了DSS誘導的FITC-葡聚糖通量（圖3D）。在組織學分析中檢測了含SP的飲食對結腸杯狀細胞的影響。AB染色顯示，SP處理的小鼠杯狀細胞數量增加（圖3E和F）。SP優先增強杯狀細胞標志物，包括mucin2（Muc2）和Muc4（圖3G和H）。免疫組化（IHC）染色分析封閉帶-1（ZO-1）進一步證實SP喂養的小鼠上皮屏障增強（圖3I）。一致地，SP喂養使ZO-1、occludin和claudin-4的mRNA水平正常化，它們是緊密連接相關蛋白的重要組成部分，在維持腸道穩態中起著至關重要的作用（圖3J-L）。綜上所述，這些結果表明補充SP可以預防DSS引起的結腸損傷。

圖3 SP預處理可防止結腸損傷

SP調節腸道微生物組的組成

鑒于腸道菌群與IBD有關，接下來研究了SP喂養是否影響微生物生態系統以及微生物群組成的變化是否與其對DSS誘導的結腸炎的保護作用有關。為了探討SP對腸道菌群組成的影響，對糞便進行了16SrRNA基因測序。Chao1指數顯示SP影響腸道微生物組結構的豐富度（圖4A）。于UniFrac的PCoA證實，DSS組整體腸道菌群結構與對照組明顯不同（R2＝0.6107，P＝0.004）（圖4B）。SP組小鼠糞便菌群結構與DSS組差異有統計學意義（R2＝0.5653，P＝0.003）。門水平分析表明，擬桿菌門、厚壁菌門和變形菌門在DSS組的糞便微生物群中占主導地位，而厚壁菌門、擬桿菌門和髕骨菌門為是SP處理小鼠的優勢門（圖4C）。DSS顯著提高了變形菌門的水平，而變形菌門的水平被SP處理顯著抑制（圖4D）。在科水平，觀察到SP處理阻止了腸桿菌科DSS驅動的升高（圖4E-G）。三元圖分析顯示，腸桿菌科是微生物群失調的常見特征，是DSS組中高度豐富的細菌類群（圖4F）。乳酸菌科（已知有利于保護腸道屏障功能）通過SP處理特別豐富（圖4E-G）。然后，分析了屬水平的腸道細菌組成。SP處理小鼠的主要細菌分類群與DSS組不同（圖4H）。在屬水平上，發現異桿菌屬、毛螺菌屬和埃希氏菌屬在DSS組中富集，而乳酸菌、毛螺菌屬_UCG-006和瘤胃球菌在SP處理的小鼠中富集（圖4H）。值得注意的是，SP處理的小鼠糞便微生物群中的主要屬是乳酸菌，其豐度約為40%（圖4H和I）。乳酸菌的豐度解釋了SP與DSS相比，在腸道微生物群中發現的厚壁菌門的大部分升高。使用Student’s t-檢驗對SP處理和DSS處理的小鼠進行細菌分類。Student’s t-檢驗還確定乳酸菌是區分SP小鼠和DSS小鼠細菌分類群的主要特征（圖4I），表明SP是一種良好的益生元，可促進有益菌，尤其是乳酸菌的生長。總體而言，SP逆轉了腸道菌群失調并改變了腸道微生物組的組成。

圖4 SP調節不同組腸道菌群組成

SP促進腸道菌群衍生代謝物的產生和活性

隨后，研究乳酸菌的豐度是否會影響其代謝物和代謝活性。在測試的4只SCFA中，SP處理的小鼠比DSS組小鼠表現出更高的丁酸濃度的趨勢（P＝0.054）（圖5A）。膽汁酸，如氯氧化膽酸（CDCA），膽酸（CA），巖性酸（LCA）和脫氧膽酸（DCA）不受SP處理的影響（圖5B）。此外，通過RT-qPCR量化了SCFA相關基因的豐度，發現游離脂肪酸受體Ffar2和Ffar3的表達沒有被SP顯著上調（圖5C）。Farnesoid X受體（FXR）和G蛋白膽汁酸受體（GPBAR1，也稱為Tgr5）的結腸mRNA表達在SP小鼠中不受影響（圖5D）。雖然SP小鼠的糞便SCFA和BAs濃度沒有顯著變化，但SP喂養小鼠糞便中乳酸的相對豐度明顯更高（圖5E）。與較高的乳酸比例一致，膳食SP產生的乳酸充分增強了其受體基因G蛋白受體（Gpr）的表達81（圖5F）。Gpr81是維持腸上皮再生的重要因子。SP通過顯著增加Wnt3的mRNA水平來激活Wnt/β-catenin通路，進一步支持上皮再生，這也通過增加β-catenin表達得到進一步證明（圖5G和H）。免疫熒光（IF）分析顯示SP喂養小鼠中β-catenin陽性細胞較高（圖5I）。此外，抗生素介導的腸道菌群耗竭顯著抑制了SP的調節作用，強烈表明SP根據腸道菌群刺激Gpr81信號通路（圖5J）。還探索了乳酸在腸道類器官模型中的功能。發現乳酸處理激活了Wnt/β-catenin通路，增加了Wnt3和β-catenin的蛋白表達，這被Gpr81拮抗劑3-OBA和Wnt拮抗劑Wnt-C59抑制（圖5K和L）。總體而言，SP的預處理調節了產乳酸細菌的功能。

圖5 SP促進了腸道菌群衍生代謝物和活性的產生

SP促進腸道干細胞（ISC）分化

由于Gpr81/Wnt/β-catenin通路已被證明可調節ISCs的增殖和再生，隨后測試了腸道微生物群中SP誘導的變化是否與宿主ISCs的影響有關。事實上，末端脫氧核苷酸轉移酶dUTP缺口末端標記（TUNEL）檢查顯示，結腸上皮細胞凋亡由DSS驅動，并因SP而顯著改善（圖6A）。一致地，SP處理顯著抑制了結腸中凋亡標志物裂解的Caspase-3（圖6B和C）。存活信號通路，p38磷酸化在SP喂養的小鼠中同時上調（圖6B和D）。Western blotting和RT-qPCR顯示，與DSS組相比，SP喂養小鼠的Lgr5水平（主要的ISC庫）上調（圖6B、E和F）。對結腸炎小鼠進行SP治療導致溶菌酶（lyz）1表達數量增加（圖6G）。經預處理的SP的DSS結腸炎小鼠上調結腸中增殖信號Ki-67的表達（圖6H和I）。同時，Spearman相關分析發現乳酸菌科、乳酸和Gpr81與ISCs的腸道屏障和再生呈正相關（圖7）。總的來說，這些發現表明SP喂養導致對ISCs增殖的正反饋以維持腸道穩態。

圖6 SP促進腸道干細胞（ISCs）的分化

圖7 Spearman的相關性分析基于預先處理或不處理SP的DSS誘導的結腸炎小鼠模型中的生化參數譜

SP治療小鼠腸道微生物群移植減輕DSS誘導的結腸炎

為了研究SP對小鼠結腸炎的有益影響是否由微生物群介導，將未經處理和SP處理的小鼠的糞便微生物群移植到食物喂養的小鼠中25 d，然后進行2% DSS。實驗設計如圖8A所示。移植SP調節的微生物群顯著減少了DSS給藥第5天的身體損失（圖8B）。SP-FMT小鼠的結腸縮短得到改善（圖8C和D）。此外，SP-FMT小鼠發生較輕的嚴重結腸炎（圖8E）。結腸炎癥標志物包括IL-1β和IL-6，在SP-FMT小鼠中顯著下調（圖8F和G）。透射電子顯微鏡檢查顯示杯狀細胞中SP-FMT小鼠中大黏蛋白顆粒計數高，表明杯狀細胞中黏蛋白的生物發生和積累增強（圖8H）。還觀察到SP調節的微生物群移植保護了DSS誘導的小鼠結腸緊密連接和刷狀緣的超微結構破壞（圖8I）。同樣，移植SP調節的微生物群增加了與維持黏膜屏障相關的基因的表達，例如ZO-1、Occludin、Muc2和Tff3（圖8J-M）。因此，這些結果表明腸道菌群有助于SP預防結腸炎。

圖8 SP處理小鼠腸道微生物群的移植減輕了DSS誘導的結腸炎

Conclusion

總之，目前的研究發現SP治療可有效預防小鼠模型中DSS誘導的結腸炎。SP通過Wnt/β-catenin通路促進結腸干細胞增殖和分化，改善腸道屏障功能，部分原因是介導微生物群組成和促進微生物群衍生乳酸的產生。這些發現對SP在結腸炎和其他炎癥性疾病中的應用具有意義。

圖9示意圖顯示了SP改善DSS誘導的結腸炎的潛在機制

Soy polysaccharide maintains colonic homeostasis to protect from dextran sulphate sodium-induced colitis by modulating gut microbiota and intestinal epithelial regeneration

Nana Zhanga, Jianlin Liua, Weiyue Zhanga, Xinxin Guoa, Shuying Lia, Hongtai Zhanga, Minjie Wangb, Bei Fana, Fengzhong Wanga,*

a Institute of Food Science and Technology, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Key Laboratory of Agro-Products Processing, Ministry of Agriculture, Beijing 100095, China

b School of Basic Medical Sciences, Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010107, China

*Corresponding author.

Abstract

Soy polysaccharide (SP) has been reported to possess the properties of modulating gut microbiome diversity. Here, we aimed to explore the protective effects of SP against dextran sulphate sodium (DSS)-induced colitis. Pre-treatment with SP at a dosage of 400 mg/kg·day alleviated colitis symptoms, preventing the weight loss and colon shorten. SP suppressed DSS-induced inflammatory response and enhanced M1 to M2 macrophage polarization. Further investigation showed that SP significantly promoted the regeneration of crypt and the expansion of goblet cell production. In addition, bacterial 16S rRNA sequencing analysis showed that SP modulated the composition of fecal microbiota, including selectively increasing Lactobacillus relative abundance. Notably, SP treatment enriched the production of Lactobacillus-derived lactic acid, which was sensed by its specific G-protein-coupled receptor 81 (Gpr81)/Wnt3/β-catenin signaling, and promoted the regeneration of intestinal stem cells. Fecal microbiome transplantation demonstrated that intestinal flora partially contributed to the beneficial effects of SP on preventing against colitis. In conclusion, SP exhibited the protective effects against colitis, which could be partly associated with modulating the composition of gut microbiota and enrichment of lactic acid. This study suggests that SP has potential to be developed as nutritional intervention to prevent colitis.

Reference:

ZHANG N N, LIU J L, ZHANG W Y, et al. Soy polysaccharide maintains colonic homeostasis to protect from dextran sulphate sodium-induced colitis by modulating gut microbiota and intestinal epithelial regeneration[J]. Food Science and Human Wellness, 2024, 13(6): 3284-3300. DOI:10.26599/FSHW.2023.9250015.

翻譯： 陳文靜（實習）

編輯：梁安琪；責任編輯：孫勇

封面圖片：圖蟲創意

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