好書(shū)推薦！《動(dòng)物行為實(shí)驗(yàn)指南》電子版pdf，網(wǎng)盤發(fā)貨

《動(dòng)物行為實(shí)驗(yàn)指南》共674頁(yè)，涵蓋了常見(jiàn)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，如小鼠、大鼠和斑馬魚(yú)，詳細(xì)描述了每一種行為測(cè)試的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、測(cè)試設(shè)備、實(shí)驗(yàn)流程、評(píng)估指標(biāo)、預(yù)期結(jié)果、常見(jiàn)問(wèn)題及解決方法、數(shù)據(jù)分析、模型應(yīng)用與局限性等各個(gè)方面。它通過(guò)快速引導(dǎo)，幫助研究人員高效地掌握實(shí)驗(yàn)的每個(gè)階段，減少了查閱文獻(xiàn)和尋找方法的時(shí)間，成為各類科研人員的重要參考資料。 《動(dòng)物行為實(shí)驗(yàn)指南》共計(jì)收錄了16種動(dòng)物行為類型，包括焦慮抑郁、學(xué)習(xí)記憶、痛覺(jué)、運(yùn)動(dòng)、恐懼、社交、癲癇、操作、成癮、視覺(jué)、癢覺(jué)、味覺(jué)、嗅覺(jué)、睡眠、斑馬魚(yú)行為以及常見(jiàn)動(dòng)物模型等內(nèi)容。每一類動(dòng)物行為下，都詳細(xì)介紹了多個(gè)經(jīng)典的實(shí)驗(yàn)范式，涵蓋了超過(guò)100種實(shí)驗(yàn)方法。 www.behaviewer.com

2025年5月9日，韓國(guó)科學(xué)技術(shù)院生物科學(xué)系Jin-Hee Han在Science Advances發(fā)表：A top-down insular cortex circuit crucial for non-nociceptive fear learning，揭示了一種自上而下的島葉皮層環(huán)路在非傷害性恐懼學(xué)習(xí)中至關(guān)重要。

理解威脅如何驅(qū)動(dòng)恐懼記憶的形成對(duì)于理解生物體如何適應(yīng)環(huán)境以及治療諸如創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙（PTSD）等與威脅相關(guān)的疾病至關(guān)重要。雖然傳統(tǒng)的巴甫洛夫條件反射研究提供了寶貴的見(jiàn)解，但對(duì)電擊作為威脅刺激的過(guò)度依賴限制了作者對(duì)多種威脅形式的理解。為了解決這一問(wèn)題，作者開(kāi)發(fā)了一種新的條件反射范式，在小鼠中使用逼近性視覺(jué)刺激作為非條件刺激（US），并鑒定出一個(gè)專門用于視覺(jué)威脅條件反射的神經(jīng)環(huán)路。臂旁核中的CGRP神經(jīng)元在條件反射的建立和記憶的提取過(guò)程中都是必需的。此外，位于后島葉皮層（pIC）的上游神經(jīng)元會(huì)對(duì)逼近性視覺(jué)刺激產(chǎn)生反應(yīng)，并且它們投射到臂旁核（PBN）的功能可以誘發(fā)厭惡狀態(tài)并驅(qū)動(dòng)條件學(xué)習(xí)。然而，這種從pIC到PBN的神經(jīng)通路在足底電擊條件反射中并非必需。這些發(fā)現(xiàn)揭示了非傷害性視覺(jué)刺激如何引發(fā)厭惡狀態(tài)和恐懼記憶的形成，從而擴(kuò)展了對(duì)厭惡US處理機(jī)制的理解。

圖一 逼近性視覺(jué)刺激可驅(qū)動(dòng)小鼠聽(tīng)覺(jué)和情境恐懼記憶的形成

作者旨在開(kāi)發(fā)一種使用逼近性視覺(jué)刺激作為非條件刺激的視覺(jué)威脅條件反射模型。該刺激由一個(gè)快速擴(kuò)大的暗色圓盤組成（在300毫秒內(nèi)從5°擴(kuò)大到35°的視覺(jué)角度），并在最大尺寸時(shí)持續(xù)500毫秒。首先確認(rèn)了這種刺激可以誘發(fā)小鼠的先天防御反應(yīng)。暴露于10次連續(xù)的逼近刺激后，小鼠表現(xiàn)出明顯的僵直行為，這種反應(yīng)可能立即發(fā)生也可能在逃跑反應(yīng)之后出現(xiàn)。其中8只動(dòng)物出現(xiàn)了立即僵直，而另外2只則先逃跑再僵直。之前有研究指出，在無(wú)庇護(hù)條件下以逃跑后僵直為主而非立即僵直。在連續(xù)5天暴露于逼近刺激的小鼠中，未觀察到僵直反應(yīng)的明顯減少。然而，當(dāng)同一刺激在短時(shí)間內(nèi)重復(fù)呈現(xiàn)（每次試驗(yàn)呈現(xiàn)5次刺激，共重復(fù)10次，每次之間間隔120秒），在第七次刺激后，僵直反應(yīng)開(kāi)始下降，表明出現(xiàn)了習(xí)慣化現(xiàn)象。這種僵直反應(yīng)的下降并不是由于防御行為模式發(fā)生了變化，因?yàn)橹貜?fù)暴露于逼近刺激并未增加逃跑行為的發(fā)生概率。盡管在第七次試驗(yàn)后觀察到了明顯習(xí)慣化的趨勢(shì)，但有些小鼠從第六次試驗(yàn)開(kāi)始，對(duì)逼近刺激的僵直水平相對(duì)于基線就已經(jīng)有所下降。基于這些結(jié)果，在后續(xù)的條件反射實(shí)驗(yàn)中采用了五次條件刺激與非條件刺激的配對(duì)方式。為了評(píng)估逼近性視覺(jué)刺激是否可以作為一種有效的非條件刺激，作者將一個(gè)中性的聽(tīng)覺(jué)音調(diào)作為條件刺激，與五次連續(xù)的逼近刺激（作為非條件刺激）進(jìn)行配對(duì)。在配對(duì)組中，音調(diào)持續(xù)20秒，并與逼近刺激的最后4秒重疊。而在非配對(duì)組中，條件刺激和非條件刺激被隨機(jī)間隔15至30秒分別呈現(xiàn)。在另一個(gè)不同環(huán)境中進(jìn)行的回憶測(cè)試中，只有配對(duì)組在聽(tīng)到音調(diào)時(shí)表現(xiàn)出明顯的僵直反應(yīng)。情境恐懼記憶則通過(guò)讓小鼠重新進(jìn)入原始的條件反射訓(xùn)練箱來(lái)評(píng)估，結(jié)果顯示兩組都表現(xiàn)出較高的僵直水平。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)表明，少于五次的條件刺激與非條件刺激配對(duì)無(wú)法建立穩(wěn)定的條件反應(yīng)。這些結(jié)果表明，一種非傷害性的視覺(jué)威脅刺激可以有效地作為非條件刺激，驅(qū)動(dòng)小鼠產(chǎn)生恐懼學(xué)習(xí)。

圖二 CGRPPBN神經(jīng)元選擇性地響應(yīng)逼近性非條件刺激和習(xí)得的聲音條件刺激，但不對(duì)中性刺激產(chǎn)生反應(yīng)

臂旁核（PBN）是一條主要的上行傷害性通路與中央杏仁核（CeA）和下丘腦有廣泛的連接，能夠調(diào)節(jié)情緒行為和自主神經(jīng)反應(yīng)。這表明它主要參與情感性疼痛的處理，而不是感知性疼痛本身。所謂情感性疼痛，指的是疼痛帶來(lái)的情緒上的不適感，這種不適會(huì)引發(fā)回避行為從而促進(jìn)恐懼學(xué)習(xí)的發(fā)生。已有研究表明，CGRP表達(dá)陽(yáng)性的臂旁核神經(jīng)元（CGRPPBN神經(jīng)元）對(duì)于足底電擊條件反射至關(guān)重要，并且通過(guò)光遺傳學(xué)激活CGRPPBN到CeA的通路可以誘導(dǎo)恐懼記憶的形成。除了在傷害性刺激處理中的作用外，CGRPPBN神經(jīng)元還對(duì)多種非傷害性厭惡刺激有反應(yīng)，并參與調(diào)控食物新奇恐懼，這表明它們?cè)诰幋a厭惡狀態(tài)方面具有更廣泛的功能。這些研究結(jié)果表明，臂旁核是一個(gè)普遍的“危險(xiǎn)探測(cè)中樞”，能夠整合各種厭惡信號(hào)并調(diào)節(jié)相關(guān)的情緒行為。因此，作者推測(cè)CGRPPBN神經(jīng)元也可能在面對(duì)視覺(jué)威脅時(shí)參與恐懼記憶的形成。首先，為了驗(yàn)證CGRPPBN神經(jīng)元是否特異性地響應(yīng)逼近性視覺(jué)刺激，在小鼠暴露于逼近刺激和閃爍刺激（作為無(wú)威脅對(duì)照）期間，對(duì)其CGRPPBN神經(jīng)元進(jìn)行了體內(nèi)光纖鈣成像記錄。在轉(zhuǎn)基因小鼠（CalcaCre）的臂旁核中注射了，閃爍刺激未能引發(fā)僵直反應(yīng)，而逼近性威脅則引發(fā)了強(qiáng)烈的僵直反應(yīng)。相應(yīng)地，CGRPPBN神經(jīng)元在面對(duì)閃爍刺激時(shí)沒(méi)有表現(xiàn)出鈣活動(dòng)的變化，但在逼近性威脅后表現(xiàn)出顯著且持續(xù)的激活（約1分鐘）。這些結(jié)果表明，CGRPPBN神經(jīng)元選擇性地響應(yīng)具有威脅性的視覺(jué)刺激，而不是中性的視覺(jué)線索。接下來(lái)，作者檢測(cè)了在視覺(jué)威脅條件反射訓(xùn)練和聲音回憶測(cè)試中CGRPPBN的活動(dòng)變化。小鼠被分為配對(duì)組和非配對(duì)組。在條件反射訓(xùn)練過(guò)程中，兩組小鼠在面對(duì)逼近性非條件刺激時(shí)都表現(xiàn)出CGRPPBN活性的增強(qiáng)。然而，在回憶測(cè)試中，只有配對(duì)組在聽(tīng)到聲音條件刺激時(shí)表現(xiàn)出鈣活動(dòng)的增加。這些發(fā)現(xiàn)表明，在條件反射建立之后，CGRPPBN神經(jīng)元編碼了聲音條件刺激所獲得的危險(xiǎn)價(jià)值，這種編碼可能依賴于突觸可塑性相關(guān)的機(jī)制。

圖三 后島葉皮層至臂旁核CGRP神經(jīng)元通路在視覺(jué)刺激和足底電擊刺激下的神經(jīng)活動(dòng)反應(yīng)

島葉皮層（IC）在恐懼、焦慮和厭惡等情緒中具有重要作用。在人類中，島葉的活動(dòng)與情感性和社會(huì)性疼痛密切相關(guān)，島葉損傷可能導(dǎo)致“疼痛無(wú)感癥”，即個(gè)體雖然能感知到疼痛，但不會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的情緒痛苦。在嚙齒類動(dòng)物中，通過(guò)光遺傳學(xué)手段激活后島葉皮層（pIC）可以誘發(fā)厭惡狀態(tài)，且pIC的神經(jīng)活動(dòng)對(duì)于維持習(xí)得的恐懼記憶是必需的，這表明它主要參與厭惡情緒的編碼，而不是單純的痛覺(jué)感知。島葉皮層也參與非傷害性恐懼條件反射過(guò)程。在小鼠中，如果抑制pIC的功能，會(huì)損害由捕食者氣味引發(fā)的恐懼學(xué)習(xí)及其回憶能力。島葉皮層與臂旁核之間存在廣泛的相互連接，作者在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)給予逼近性視覺(jué)刺激時(shí)，pIC投射到CGRP陽(yáng)性神經(jīng)元的通路（pIC→CGRP-PBN）表現(xiàn)出顯著增強(qiáng)的神經(jīng)活動(dòng)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證pIC→CGRP-PBN神經(jīng)元是否選擇性地響應(yīng)威脅刺激進(jìn)行了光纖鈣成像記錄。在pIC→CGRP-PBN神經(jīng)元中表達(dá)了鈣指示蛋白GCaMP6s，接著讓小鼠分別暴露于逼近刺激與足底電擊刺激，或閃爍刺激與足底電擊刺激組合中。光纖記錄結(jié)果顯示，這兩種刺激都會(huì)持續(xù)激活pIC→CGRP-PBN神經(jīng)元，但它們的激活動(dòng)態(tài)有所不同：對(duì)逼近刺激的反應(yīng)較慢，而對(duì)足底電擊的反應(yīng)則迅速上升。相比之下，閃爍刺激未能激活pIC→CGRP-PBN神經(jīng)元，而足底電擊則引發(fā)了強(qiáng)烈的神經(jīng)反應(yīng)。這些結(jié)果表明，pIC→CGRP-PBN神經(jīng)元選擇性地響應(yīng)威脅性刺激，而不是對(duì)所有感官刺激都做出反應(yīng)。此外，pIC→CGRP-PBN神經(jīng)元在威脅刺激結(jié)束后仍保持活躍狀態(tài)，這表明它們可能參與了持續(xù)性厭惡狀態(tài)的編碼，而不僅僅是短暫的威脅檢測(cè)。它們對(duì)逼近性刺激的長(zhǎng)時(shí)間響應(yīng)也與之前在CGRPPBN神經(jīng)元中觀察到的持續(xù)性激活相似，提示pIC的輸入可能是導(dǎo)致CGRPPBN長(zhǎng)時(shí)間激活的重要因素。

圖四 光遺傳學(xué)刺激 pIC→CGRP-PBN投射可誘導(dǎo)焦慮樣行為

作者的數(shù)據(jù)表明，從pIC到PBN的神經(jīng)通路在視覺(jué)威脅條件反射中起到了US通路的作用，該通路可能傳遞厭惡的情緒信息。因此，進(jìn)一步研究了直接激活該通路是否能夠誘發(fā)厭惡情緒狀態(tài)并足以驅(qū)動(dòng)威脅條件反射。為此，對(duì)pIC→CGRP-PBN神經(jīng)元進(jìn)行了光遺傳學(xué)操控，在臂旁核中刺激它們的軸突末梢。為了評(píng)估厭惡行為，進(jìn)行了實(shí)時(shí)位置回避實(shí)驗(yàn)（RTPA）、曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)（OFT）和高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)（EPM）。在RTPA實(shí)驗(yàn)中，小鼠被放置在一個(gè)三室裝置中，其中一側(cè)空間與對(duì)pIC→CGRP-PBN軸突末梢的光刺激配對(duì)。對(duì)照組（EYFP組）在各房間之間無(wú)明顯偏好，而實(shí)驗(yàn)組（ChR2組）則顯著避開(kāi)了與光刺激配對(duì)的那一側(cè)空間。在OFT中，光刺激與60秒間隔交替進(jìn)行。ChR2組并未表現(xiàn)出更多的僵直反應(yīng)，這表明光激活pIC→CGRP-PBN并不會(huì)引發(fā)僵直行為。然而，ChR2小鼠表現(xiàn)出更高的焦慮水平，表現(xiàn)為在中心區(qū)域停留時(shí)間更短、穿越次數(shù)更少，盡管其總體運(yùn)動(dòng)距離與對(duì)照組相似。在EPM實(shí)驗(yàn)中，光刺激在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中以“開(kāi)2秒、關(guān)2秒”的方式交替進(jìn)行。ChR2組比對(duì)照組更多地停留在封閉臂中。此外，進(jìn)入開(kāi)放臂的次數(shù)在ChR2組顯著減少，而兩組之間的總運(yùn)動(dòng)距離基本一致。這些結(jié)果表明，在PBN中激活pIC→CGRP-PBN投射可以誘導(dǎo)出厭惡性情緒行為狀態(tài)。接下來(lái)，進(jìn)一步驗(yàn)證在PBN中對(duì)pIC→CGRP-PBN投射的光刺激是否可以作為非條件刺激來(lái)驅(qū)動(dòng)威脅條件反射。作者在pIC→CGRP-PBN神經(jīng)元中特異性表達(dá)了ChR2，在條件反射訓(xùn)練中，將五次光刺激與聲音條件刺激（tone CS）配對(duì)呈現(xiàn)。在隨后的聲音回憶測(cè)試中，只有ChR2組在聽(tīng)到聲音時(shí)表現(xiàn)出比聽(tīng)前更強(qiáng)的僵直反應(yīng)，而對(duì)照組則沒(méi)有。這些研究結(jié)果表明，pIC→CGRP-PBN神經(jīng)元將厭惡的情緒信息傳遞至PBN，且該通路本身就足以驅(qū)動(dòng)威脅條件反射的發(fā)生，揭示了一條獨(dú)特且關(guān)鍵的威脅學(xué)習(xí)神經(jīng)環(huán)路。

在這項(xiàng)研究中，作者建立了一個(gè)使用逼近性視覺(jué)刺激作為非條件刺激的小鼠視覺(jué)威脅條件反射模型。發(fā)現(xiàn)CGRPPBN神經(jīng)元在視覺(jué)威脅條件反射中起關(guān)鍵作用，并且在傷害性和非傷害性非條件刺激引發(fā)的恐懼學(xué)習(xí)中都具有更廣泛的功能。pIC→CGRP-PBN和CGRPPBN神經(jīng)元均表現(xiàn)出對(duì)威脅刺激的選擇性反應(yīng)，并且pIC-PBN通路對(duì)于視覺(jué)威脅條件反射至關(guān)重要，但在足底電擊條件反射中并非必需。更重要的是，在臂旁核中激活pIC→CGRP-PBN投射可以誘發(fā)厭惡情緒狀態(tài)，并足以驅(qū)動(dòng)恐懼記憶的形成。這些發(fā)現(xiàn)表明，pIC→CGRPPBN通路是非傷害性危險(xiǎn)信號(hào)的主要非條件刺激通路。

文章來(lái)源

10.1126/sciadv.adt6996