【寫在前面】：本期推薦的是由溫州醫科大學研究團隊近期發表于Phytomedicine(IF=6.7）的一篇文章，揭示郁金（Curcuma wenyujin）提取物通過PINK1/Parkin介導的自噬減輕阿爾茨海默病（AD）的認知缺陷并抑制焦亡。

【期刊簡介】

【題目及作者信息】

Curcuma wenyujin extract alleviates cognitive deficits and restrains pyroptosis through PINK1/Parkin mediated autophagy in Alzheimer's disease

背景：焦亡（pyroptosis）和線粒體自噬（mitophagy）在阿爾茨海默病（AD）治療中受到廣泛關注。郁金（Curcumae Radix，CR）是姜科植物溫郁金（Curcuma wenyujin Y. H. Chen et C. Ling）的干燥根莖，作為一種傳統中藥被廣泛用于治療神經系統疾病。然而，其在AD中的作用及其機制尚不清楚。

目的：本研究旨在探索郁金在AD治療中的活性成分及其潛在機制。

方法：通過超高效液相色譜-三重飛行時間質譜（UHPLC-Triple-TOF/MS）對郁金提取物進行定性分析。Aβ1-42誘導的AD模型小鼠接受為期三周的每日灌胃給藥處理。通過Y迷宮、新物體識別和八臂迷宮測試評估AD模型小鼠的認知能力。利用定量蛋白質組學鑒定郁金提取物的治療靶點。在體內外實驗中，通過Western blot（WB）、免疫熒光（IF）染色和ELISA實驗檢測其對焦亡和線粒體自噬的影響。

結果：郁金提取物的乙酸乙酯（EAC）組分表現出最佳的抗AD效果。郁金提取物能夠改善Aβ1-42誘導的小鼠的記憶和認知能力，改善神經元形態，并減少大腦中Aβ的積累。蛋白質組學分析提示，郁金的抗AD特性可能涉及炎癥減輕、細胞存活增強和線粒體自噬調節。在AD小鼠和Aβ誘導的SH-SY5Y細胞中，郁金處理均導致焦亡減少、LC3和Beclin1水平增加以及PINK1/Parkin通路的激活。

結論：郁金提取物的乙酸乙酯組分通過減輕焦亡、減少神經炎癥和促進線粒體自噬發揮抗AD作用，這些作用是通過PINK1/Parkin通路實現的。

（圖文摘要）

【前言】

阿爾茨海默病（AD）是一種進展性神經退行性疾病，其特征為認知功能障礙和記憶衰退。目前尚無完全治愈AD的方法，因此尋找神經保護策略仍是全球公共衛生領域的一個關鍵問題。AD的發病機制假說包括淀粉樣蛋白假說、tau蛋白過度磷酸化、膽堿能假說、朊蛋白假說以及氧化應激等。其中，β-淀粉樣蛋白（Aβ）被認為是AD發病機制的主要原因之一。因此，針對Aβ的干預是目前抗AD的主要策略。

線粒體功能障礙會導致Aβ大量沉積和tau蛋白的磷酸化。研究表明，AD患者存在細胞內物質清除和循環功能障礙。因此，恢復線粒體功能和完整性可能是治療AD的有效方法，而促進線粒體自噬有助于降低Aβ水平。線粒體功能的調節，包括線粒體生物合成、動態平衡和線粒體自噬，對于維持神經元的正常功能至關重要。線粒體自噬是指細胞內受損線粒體的選擇性清除，涉及PINK1/Parkin和FUNDC1等機制。PINK1/Parkin信號通路在神經退行性疾病的發展中發揮重要作用。PINK1是一種位于線粒體外膜的絲氨酸/蘇氨酸激酶，通過內外膜轉運體的協同作用整合到線粒體中。進入線粒體后，PINK1被基質金屬蛋白酶和與早老素相關的菱形蛋白降解，從而無法激活細胞質中的Parkin。然而，線粒體損傷使PINK1能夠自磷酸化并招募Parkin，后者與p62和LC3相互作用，通過溶酶體蛋白酶降解受損線粒體。在AD患者中，線粒體功能受損和PINK1水平顯著下降突顯了其在疾病發病機制中的關鍵作用。此外，AD小鼠模型的研究表明，PINK1基因敲除會加劇神經炎癥、增加Aβ積累，并損害認知和記憶功能，強調了PINK1/Parkin通路在維持認知能力和記憶完整性中的核心作用。

在AD的進展過程中，可溶性Aβ寡聚物會誘導神經炎癥和神經元損傷。這一過程涉及Nod樣受體蛋白3（NLRP3）炎癥體的激活，從而在AD的發病機制中引發重要的免疫炎癥反應。抑制NLRP3炎癥體已被證明能夠改善AD動物模型的記憶和認知缺陷。炎癥體的激活導致依賴于Caspase-1的促炎細胞因子（如IL-1β和IL-18）的釋放，從而促進焦亡過程。NLRP3激活的啟動因素包括活性氧（ROS）的產生、線粒體DNA的釋放以及NLRP3炎癥體向與心磷脂相關的線粒體位點的轉位，突顯了線粒體在NLRP3驅動的炎癥中的關鍵作用。

郁金（Curcumae Radix，CR）是姜科植物溫郁金（Curcuma wenyujin Y. H. Chen et C. Ling）的干燥根莖，原產于中國東南部，是一種廣泛使用的中藥。藥理學和臨床研究表明，CR具有多樣的藥理活性，包括抗腫瘤、抗炎和抗氧化特性。《溫病全書》中記載的菖蒲郁金湯（由石菖蒲和郁金組成）被廣泛用于治療癡呆和其他神經系統疾病。盡管CR提取物表現出抗AD的特性，但其潛在機制尚不清楚。本研究旨在探索CR在AD治療中的活性成分及其可能的作用機制。

因此，本研究首先采用超高效液相色譜-三重飛行時間質譜（UHPLC-Triple-TOF/MS）對CR進行定性分析，隨后使用不同極性溶劑進行提取。我們建立了Aβ1-42誘導的AD小鼠模型，并通過行為學實驗確定了活性成分。進一步研究表明，CR的乙酸乙酯（EAC）組分可以通過減輕焦亡、減少神經炎癥以及通過PINK1/Parkin信號通路促進線粒體自噬來緩解AD。

【結果】

1、郁金乙醇提取物的成分分析

為了分析郁金（CR）的成分，我們首先通過Google Scholar、SciFinder等數據庫對其化學成分進行檢索，并從ChemSpider、ChemBook、MassBank、PubMed等數據庫中獲取了相應的化學成分信息，包括化合物名稱、分子式、分子量等，從而建立了郁金化合物數據庫。通過超高效液相色譜-三重飛行時間質譜（UHPLC-Triple-TOF/MS）在正負離子模式下檢測到45種化合物，具體信息見表S4。檢測到的化合物包括2種苯丙素類、33種倍半萜類、1種酚酸、1種去甲倍半萜類、2種生物堿、2種苯衍生物、1種甾醇和3種脂肪酸。郁金提取物的BPI色譜圖如圖1A和B所示。倍半萜類被發現是郁金的主要成分，因此我們以curcarabranol和13-羥基革菌酮為例，研究了它們的裂解路徑（圖1C和D）。

2、郁金提取物對Aβ1-42誘導的AD小鼠行為表現的影響

我們首先考察了不同濃度的郁金（1200、2400和4800 mg/kg）的抗AD效果。綜合行為學分析顯示，2400 mg/kg和4800 mg/kg的劑量表現出相當的療效，顯示出顯著的抗AD活性，明顯優于1200 mg/kg（圖S1）。因此，后續研究選擇了2400 mg/kg的劑量。郁金的總乙醇提取物（TT）通過水和有機溶劑分離，得到石油醚（PE）、乙酸乙酯（EAC）、正丁醇（NB）和水（WA）提取物。各組的劑量是根據其提取率確定的（圖2A）。經過3周的處理后，首先通過Y迷宮測試小鼠的空間信息處理能力（圖2B）。所有組的小鼠總入臂次數均無顯著差異，表明處理對小鼠的運動能力無影響（圖2C）。TT和EAC顯著提高了自發交替率，且TT的效果優于用于阿爾茨海默病治療的植物來源藥物石杉堿甲（HupA）（Li等，2022）。隨后，通過新物體識別（NOR）實驗考察短期和長期記憶。如圖2E-G所示，TT和EAC均提高了短期和長期記憶的辨別指數。進一步通過八臂迷宮實驗評估發現，隨著訓練天數的增加，所有接受郁金提取物處理的小鼠在短期工作記憶錯誤和總記憶錯誤方面均有不同程度的減少。值得注意的是，只有TT、NB、EAC和HupA顯著改善了長期參考記憶錯誤（圖2H-K）。

綜上所述，這些結果表明乙酸乙酯組分（EAC）是郁金提取物的活性部分。

3、郁金提取物改善Aβ1-42誘導小鼠的神經元形態，降低Aβ水平，并抑制凋亡

海馬的CA1、CA3和齒狀回（DG）區域被認為與記憶和認知功能密切相關，因此被選為觀察對象。通過蘇木精-伊紅（HE）染色和尼氏（Nissl）染色來檢查神經元形態。模型組顯示出神經元數量減少、排列紊亂、細胞輪廓模糊以及核固縮和空泡變性增加。此外，模型組尼氏小體數量減少，表明Aβ暴露導致嚴重的神經損傷。相比之下，TT（總提取物）、EAC（乙酸乙酯組分）和HupA（石杉堿甲）組的神經元整體形態、細胞排列和尼氏小體數量均得到改善，而其他組在神經元形態上未顯示出顯著增強（圖3A和B）。

此外，通過硫黃素S（Th-S）染色和Aβ免疫熒光實驗檢測Aβ沉積水平，結果表明TT和EAC均能有效降低Aβ1-42誘導小鼠的Aβ沉積（圖3C和D，圖S2）。

4、鑒于神經損傷通常伴隨凋亡，我們采用TUNEL染色來探究郁金是否能促進神經元存活

結果顯示，TT和EAC處理均顯著降低了CA1、CA3和DG區域的凋亡率，表明其促進了神經元存活（圖4）。 綜上所述，這些結果進一步證實了乙酸乙酯組分（EAC）是郁金提取物的活性部分，并為其后續深入研究提供了依據。

5、TMT定量蛋白質組學分析揭示了CR提取物的體內治療靶點

通過TMT（Tandem Mass Tags）定量蛋白質組學分析，研究了CR提取物在體內的治療靶點。共定量了4212種蛋白質。模型組表現出144種差異表達蛋白，包括60種上調和84種下調蛋白。與模型組相比，總提取物（TT）組表現出251種差異表達蛋白，其中108種上調，143種下調；而乙酸乙酯組分（EAC）組表現出64種差異表達蛋白，其中36種上調，28種下調（圖5A）。與模型組相比，EAC和TT均能有效逆轉異常表達模式。聚類分析顯示，TT、EAC和對照組之間蛋白質表達無顯著差異（圖5B和C）。GO分析表明，差異表達蛋白主要涉及對氮饑餓的細胞反應、線粒體自噬和凋亡過程（生物過程，BPs）。細胞組分（CCs）主要涉及線粒體、自噬體和細胞質，而分子功能（MFs）主要與泛素蛋白連接酶結合、蛋白質結合和核苷酸結合相關（圖5D）。KEGG分析進一步顯示，模型組和EAC組之間差異蛋白涉及的信號通路主要與線粒體自噬、自噬和NF-κB通路相關（圖5E）。這些結果表明，CR的抗AD作用可能通過抑制炎癥、促進細胞存活和調節線粒體自噬實現。

6、CR提取物抑制Aβ1-42誘導小鼠的焦亡

基于蛋白質組學結果，研究進一步探討了CR提取物對焦亡的影響。焦亡是一種由Caspase-1介導的促炎性程序性細胞死亡，會加劇神經損傷。Western blot分析顯示，TT和EAC顯著提高了Bcl-2/Bax比值，同時降低了焦亡相關標志物（包括NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18和ASC）的水平（圖6A-F）。此外，TT和EAC處理還降低了IL-1β和IL-18的mRNA水平（圖6G-H）。這些數據表明CR提取物能有效減輕Aβ介導的焦亡。

7、CR提取物通過PINK1/Parkin通路改善Aβ1-42誘導小鼠的線粒體自噬

線粒體功能障礙與Aβ沉積有關。研究首先檢測了關鍵自噬標志物：Beclin1（自噬流標志物）、p62和LC3（自噬形成標志物），這些標志物均被TT和EAC處理增強（圖7A-D）。相反，線粒體標志物TOM20和細胞色素c氧化酶IV（COX IV）被TT和EAC處理降低，表明促進了線粒體自噬（圖7E和F）。PINK1/Parkin是著名的線粒體自噬信號通路，與神經退行性疾病的進展密切相關。Western blot分析顯示，TT和EAC處理上調了PINK1和Parkin的水平，表明激活了PINK1通路（圖7G和H）。

8、線粒體自噬的發生通常伴隨著線粒體外膜TOM20表達的降低。為了準確評估線粒體自噬的發生并減少假陽性，研究采用免疫熒光技術檢測LC3和TOM20的共定位。 結果顯示，TT和EAC處理顯著增加了LC3和TOM20的共定位（ 圖8）。 這些數據表明，CR通過PINK1/Parkin通路改善了線粒體自噬。

9、EAC通過PINK1/Parkin通路減輕Aβ1-42誘導的SH-SY5Y細胞的焦亡并促進自噬

為了進一步驗證郁金（CR）對Aβ誘導的神經元損傷的保護作用，我們建立了Aβ1-42誘導的SH-SY5Y細胞模型。總提取物（TT）和乙酸乙酯組分（EAC）在0-40 μg/mL的濃度范圍內均未表現出細胞毒性（圖9A和B）。10、20和40 μg/mL的EAC顯著提高了細胞活性，而只有40 μg/mL的TT表現出保護作用（圖9C）。在相同濃度下，EAC的保護效果優于TT。通過免疫熒光方法檢測LC3和TOM20的共定位，結果顯示TT和EAC處理均顯著增加了SH-SY5Y細胞中LC3和TOM20的共定位（圖9D和E）。

10、EAC在體外激活PINK1/Parkin信號通路

與體內結果一致，40 μg/mL的EAC提高了PINK1和Parkin的水平，增加了LC3-II/LC3-I的比值，降低了TOM20和COX IV的水平，其效果與陽性對照藥物雷帕霉素相當（圖10A-F）。

11、PINK1是CR提取物在Aβ1-42誘導的SH-SY5Y細胞中發揮神經保護作用的關鍵

為了確認PINK1在CR抗AD作用中的參與，我們使用特異性siRNA敲低了PINK1的表達。PINK1的沉默消除了TT和EAC的細胞保護活性（圖S4）。此外，在PINK1沉默后，我們進一步研究了PINK1在CR抑制焦亡中的作用。在未沉默PINK1的情況下，EAC顯著降低了Caspase-1、NLRP3、IL-1β和IL-18的水平，與之前的結果一致（圖11A-E）。然而，這些抑制效果在PINK1沉默后被逆轉，表明EAC通過PINK1/Parkin通路抑制焦亡。

同樣，通過TUNEL染色檢測到40 μg/mL的EAC抑制了Aβ1-42誘導的SH-SY5Y細胞的凋亡，但在PINK1沉默后，其抗凋亡能力消失（圖11F-G）。為了研究EAC處理是否能改善線粒體功能，我們通過JC-1染色評估了線粒體膜電位（MMP）水平。EAC處理增加了JC-1聚合體/單體的比值，但在使用siRNA沉默PINK1后，這種效果未被觀察到（圖11H-I）。總體而言，這些發現表明PINK1是EAC對抗Aβ誘導的神經元損傷的神經保護作用的關鍵。

郁金（Curcumae Radix，CR）是一種傳統中藥，主要用于活血化瘀。Aβ沉積是阿爾茨海默病（AD）的主要病因。在中醫理論指導下，我們將Aβ視為“瘀血”，并研究了CR的抗AD作用及其潛在機制。本研究中，CR的乙酸乙酯提取物（EAC）相比其他提取物表現出最顯著的抗AD效果。這種神經保護作用可能通過激活PINK1/Parkin信號通路、促進線粒體自噬和抑制焦亡來實現。本研究結果為CR在AD管理中的藥理學研究提供了寶貴的見解。

盡管已有研究關注CR的神經保護作用，但其抗AD活性成分和潛在作用機制尚不清楚。在本研究中，我們通過UHPLC-Triple-TOF/MS對CR提取物的化學成分進行了全面分析，發現其主要成分為倍半萜類化合物。以往對CR倍半萜類的研究主要集中在抗腫瘤作用上，而其神經保護作用鮮有研究。我們使用不同有機溶劑提取CR，并將這些提取物應用于AD模型小鼠。結合行為學數據和HE及尼氏染色結果，發現EAC的抗AD效果與總提取物（TT）最為接近，且優于石杉堿甲（HupA）。因此，EAC是CR中治療AD的有效部分。此外，既往研究表明，CR的乙酸乙酯提取物具有抗炎、鎮痛以及抗抑郁作用。因此，我們的研究結果為未來探索EAC中對抗AD有貢獻的活性成分奠定了基礎。

根據蛋白質組學結果，我們重點關注了與焦亡和線粒體自噬相關的信號通路。特定炎癥體的激活和焦亡已被確定為AD病理的關鍵特征。焦亡是一種依賴Caspase-1的炎癥性程序性細胞死亡，兼具凋亡和壞死的特征。這一過程導致促炎細胞質內容物的釋放，最終導致細胞裂解。在正常生理條件下，受體蛋白NLRP3、凋亡相關斑點蛋白ASC和Caspase-1結合形成NLRP3炎癥體。而在焦亡過程中，Caspase-1隨后被切割并激活，將促炎細胞因子pro-IL-1β和pro-IL-18轉化為具有生物活性的IL-1β和IL-18。既往研究表明CR具有抗炎作用，但其對神經元焦亡的抑制作用尚未被報道。在本研究中，我們發現AD模型小鼠和Aβ誘導的SH-SY5Y細胞中NLRP3、IL-1β和IL-18的水平顯著增加，并伴有明顯的凋亡，表明發生了嚴重的焦亡。CR處理后，異常的焦亡被顯著抑制。

AD是一種復雜且不可逆的神經退行性疾病。受損線粒體的積累已成為AD患者和動物模型中受損神經元的特征性表現，可能發生在認知障礙出現之前。線粒體自噬減少會加劇Aβ和tau蛋白的病理沉積，而增強線粒體自噬干預有助于維持突觸可塑性和認知功能。此外，聚集的Aβ會進一步損害神經元的線粒體自噬功能。因此，線粒體自噬功能障礙觸發了導致AD中突觸功能障礙和神經元丟失的惡性神經退行性循環。CR在傳統中醫中被認為具有活血化瘀的作用。一些研究表明，化瘀作用與自噬相關通路密切相關。某些活血化瘀的中藥可以增強自噬，促進Aβ和tau的清除，從而有助于AD的治療。因此，結合中醫理論和蛋白質組學結果，我們研究了CR調節線粒體自噬的潛力。PINK1/Parkin通路是線粒體自噬的關鍵調節因子。既往研究表明，PINK1的過表達可以逆轉線粒體動態異常，恢復線粒體自噬，并增加海馬區的ATP水平。腺相關病毒（AAV）介導的PINK1過表達已被證明可以預防海馬區的認知缺陷和病理變化，而PINK1基因敲除則顯著加劇了AD小鼠的病理變化。此外，研究表明，在APP/PS1小鼠和AD患者中，隨著疾病的進展，tau蛋白介導的Parkin共表達增加，導致細胞質中Parkin水平下降，線粒體表面招募受損，最終影響線粒體自噬功能（Reddy和Oliver，2019）。這些研究表明，通過PINK1/Parkin信號通路增強線粒體自噬可以改善線粒體功能，為AD的治療提供了新的見解。在本研究中，AD模型中PINK1和Parkin水平顯著降低，而CR處理后，PINK1/Parkin信號通路被顯著激活，LC3-II/LC3-I比值和Beclin1水平提高，TOM20和COX IV水平降低。這些結果表明CR可以增強AD中的線粒體自噬。此外，JC-1染色結果顯示，CR處理顯著改善了受損細胞的線粒體膜電位（MMP）水平，表明CR還能夠改善線粒體功能。已有研究表明，線粒體在焦亡過程中受損。然而，PINK1/Parkin信號通路與焦亡之間的聯系尚不清楚。因此，我們隨后敲低了PINK1基因。PINK1敲低后，EAC提取物對焦亡和線粒體功能障礙的保護作用被逆轉，表明CR通過激活PINK1/Parkin通路發揮抗AD作用。

【總結】

線粒體質量控制系統功能障礙是AD導致認知功能障礙和神經損傷的關鍵因素。CR處理可以有效調節這一質量控制系統，抑制焦亡并發揮神經保護作用（圖12）。PINK1作為AD治療的潛在靶點，有望成為未來研究的焦點，可能會增強AD治療策略。

【結論】

本研究表明，CR的乙酸乙酯提取物（EAC）是治療AD的有效部分。EAC顯著抑制了焦亡，減少了神經炎癥，并通過調節PINK1/Parkin信號通路促進了線粒體自噬。這些發現表明，促進線粒體自噬和抑制焦亡是AD治療的有前景的策略。CR的EAC提取物可能是預防AD損傷的有前景的植物藥物候選物。

注：本文原創表明為原創編譯，非聲張版權，侵刪！

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