【寫在前面】：本期推薦的是由華中科技大學同濟醫(yī)學院研究團隊近期發(fā)表于Journal of Ethnopharmacology(IF4.8）的一篇文章，揭示毛冬青皂苷A1調(diào)節(jié)血小板功能的藥理作用及機制。

【期刊簡介】

【題目及作者信息】

Pharmacological effects and mechanism of Ilexsaponin A1 in modulating platelet function

民族藥理學相關(guān)性：毛冬青為促進血液循環(huán)的中藥。毛冬青皂苷 A1（IsA）是該化合物的單體，具有促血管生成、抗凋亡和抗炎活性。然而，IsA 對血小板的影響及其藥理作用和具體機制尚不清楚。

研究目的：本研究旨在探討 IsA 的抗血小板作用及其潛在的分子機制。

材料與方法：采用血小板聚集儀檢測血小板聚集和 ATP 釋放。通過流式細胞術(shù)評估 P-選擇素的暴露、整合素 αIIbβ3 的激活和鈣離子的動員。熒光顯微鏡用于觀察血小板的鋪展。通過數(shù)碼相機成像觀察血栓回縮。采用免疫印跡分析檢測血小板中主要信號通路的蛋白磷酸化調(diào)節(jié)。多普勒血流測量法用于研究 IsA 在 FeCl? 誘導的頸動脈損傷模型中的體內(nèi)作用。尾靜脈切斷法用于測量出血時間。

結(jié)果：IsA 劑量依賴性地抑制膠原、U46619、凝血酶和 ADP 誘導的血小板聚集和 ATP 釋放。它還抑制凝血酶誘導的 P-選擇素的暴露和 PAC-1 的結(jié)合。此外，IsA 抑制細胞內(nèi)鈣離子的動員和細胞外鈣離子的內(nèi)流。它還影響整合素 αIIbβ3 的外-內(nèi)信號傳導通路，包括抑制血小板的鋪展、血栓回縮和外-內(nèi)信號分子的磷酸化。此外，IsA 抑制 Syk-PLCγ2、PI3K-Akt-GSK3β 和 MAPKs 蛋白的磷酸化，這些是膠原和凝血酶受體的下游效應因子。

結(jié)論：IsA 抑制血小板功能和血栓形成。這有可能被開發(fā)成治療血栓性疾病的新療法。

（圖文摘要）

【前言】

血栓是心血管疾病的重要并發(fā)癥，全球約25%的死亡率與之相關(guān)，且其發(fā)病率還在上升。血栓性疾病涵蓋動脈與靜脈血栓栓塞，典型如心肌梗死、缺血性中風、深靜脈血栓及肺栓塞。動脈血栓含大量血小板，而靜脈血栓主要由紅細胞與纖維蛋白構(gòu)成，但活化血小板也能黏附于內(nèi)皮并參與凝血過程。由此可見，血小板在血栓形成中起關(guān)鍵作用，是治療和預防血栓性疾病的重要靶點。

血小板是直徑1-3μm的無核血細胞碎片，源于骨髓巨核細胞的細胞質(zhì)。在血管損傷時，血小板通過多種機制黏附于內(nèi)皮下基質(zhì)，如von Willebrand因子（vWF）與GPIb相互作用，膠原與α2β1和GPVI受體結(jié)合。同時，血小板釋放ADP、ATP、纖維蛋白原、vWF等物質(zhì)。致密管系統(tǒng)（DTS）開放使細胞質(zhì)鈣（Ca2+）增加，磷脂酶A2（PLA2）激活，進而促進血栓素A2（TXA2）和凝血酶的合成。整合素αbIIβ3是血小板和巨核細胞特有的表面受體，未激活的血小板表面通常有70000 - 90000個該受體，其激活涉及構(gòu)象狀態(tài)依賴的動態(tài)結(jié)合親和力變化，從低親和力到高親和力，進而導致血小板聚集。

活化血小板在循環(huán)中招募并激活其他血小板，聚集形成止血栓修復血管損傷。正常生理狀態(tài)下，內(nèi)皮細胞釋放一氧化氮（NO）和前列腺素I2（PGI2）等抑制因子，使血栓形成控制在一定范圍內(nèi)。但在疾病狀態(tài)下，這種平衡可能被打破，導致過度出血或血栓形成。

目前，多種抗血小板藥物已用于臨床，如氯吡格雷、普拉格雷、坎格雷洛是腺苷二磷酸（ADP）受體P2Y12拮抗劑；阿昔單抗、依替非巴肽、替羅非班是GPIIb/IIIa復合體拮抗劑；阿司匹林是環(huán)氧化酶（COX）抑制劑。阿司匹林與氯吡格雷聯(lián)合使用可預防有出血并發(fā)癥患者血栓形成，是管理高危冠狀動脈疾病的主要策略。然而，這些藥物存在出血風險、耐藥性和胃腸道反應等挑戰(zhàn)，因此新型抗血小板藥物的研發(fā)備受關(guān)注。深入研究血小板功能及靶向活化信號分子，有望發(fā)現(xiàn)新的抗血小板藥物，提高抗血栓效率，同時降低不良影響。

毛冬青（Ilex pubescens Hook. & Arn.）是冬青科冬青屬植物。《廣西本草選編》記載其味苦、性涼，有清熱解毒、消腫止痛、活血化瘀的功效。《中華本草》中記載其用于治療冠心病、腦血栓、血栓性靜脈炎等心血管疾病。毛冬青的主要化學成分包括三萜皂苷、木脂素苷、黃酮類、酚苷和苯乙醇衍生物，其中毛冬青皂苷A1（IsA）是其含量豐富的皂苷類代表性成分。研究表明，IsA具有促血管生成、抗凋亡、抗炎、調(diào)節(jié)腸道菌群和膽汁酸代謝等活性，但其與血小板的具體相互作用尚未完全明確。本研究旨在探討IsA對血小板活化和血栓形成的影響，并確定其涉及的細胞內(nèi)信號通路。

【結(jié)果】

3.1. IsA 抑制各種激動劑誘導的血小板聚集

為確定 IsA 對血小板聚集的影響，我們先用 IsA 預處理血小板，再用不同可溶性小分子激動劑刺激，包括凝血酶（0.04 U/ml）、膠原（1 μg/ml）、U46619（0.3 μM）和 ADP（2 μM）。結(jié)果顯示，IsA 能以劑量依賴方式抑制激動劑誘導的血小板聚集。為排除聚集減少由細胞死亡引起，我們通過檢測 LDH 釋放評估 IsA 對血小板的細胞毒性。結(jié)果表明，IsA 預處理后 LDH 水平無顯著升高，說明在實驗劑量下血小板未受損。

3.2. IsA 對血小板顆粒分泌和整合素 αIIbβ3 激活的抑制作用

血小板激活伴隨顆粒分泌，其中致密顆粒釋放 ATP，α 顆粒釋放 P 選擇素。我們先用不同劑量 IsA 預處理血小板 5 分鐘，再用凝血酶（0.04 U/mL）、膠原（1 μg/mL）和 U46619（0.3 μM）刺激。結(jié)果顯示，IsA 抑制了上述三種激動劑誘導的 ATP 釋放。流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，IsA 降低了 P 選擇素暴露的熒光信號。靜息血小板中整合素處于低親和力狀態(tài)，受激動劑刺激時，αIIbβ3 構(gòu)象轉(zhuǎn)變?yōu)楦哂H和力狀態(tài)，這一過程稱內(nèi)部信號傳導或整合素 αIIbβ3 激活。實驗數(shù)據(jù)表明，IsA 顯著抑制了凝血酶激活的整合素 αIIbβ3 與 PAC-1 的結(jié)合。

3.3. IsA 抑制整合素 αIIbβ3 介導的外 - 內(nèi)信號傳導

整合素 αIIbβ3 能傳導雙向信號。除上述的內(nèi)部信號傳導外，血小板上的激活整合素 αIIbβ3 與纖維蛋白原結(jié)合會觸發(fā)外 - 內(nèi)信號傳導。這引發(fā)信號級聯(lián)反應，介導不可逆的穩(wěn)定血小板黏附、鋪展和血栓回縮。經(jīng) 100 μM 或 400 μM IsA 處理的血小板與僅用載體處理的相比，在纖維蛋白原包被表面上鋪展和黏附減少。就血小板血栓回縮而言，僅觀察到經(jīng) 400 μM IsA 處理的血小板有抑制效果。整合素激活后，Src 家族激酶在酪氨酸磷酸化事件中起主要作用，包括 β3 羧基末端尾部 NxxY 動機內(nèi)酪氨酸磷酸化。黏著斑激酶是整合素信號傳導的早期介質(zhì)，在 αIIbβ3 激活后發(fā)生酪氨酸殘基磷酸化。為深入探究 IsA 對血小板整合素 αIIbβ3 外 - 內(nèi)信號傳導的影響，我們收集了鋪展后與 400 μM IsA 或載體共孵育的血小板樣本，并進行免疫印跡分析。結(jié)果表明，400 μM IsA 可抑制 β3、Src 和 FAK 的磷酸化。這些發(fā)現(xiàn)共同證明，IsA 對血小板整合素 αIIbβ3 的信號傳導有抑制作用，還影響血小板鋪展、黏附和血栓回縮等功能。

3.4. IsA 抑制血小板鈣離子動員

激動劑誘導的細胞內(nèi) Ca2+ 濃度增加對血小板在止血和血栓形成中的激活至關(guān)重要，包括 Ca2+ 從細胞內(nèi)儲存釋放和通過質(zhì)膜進入細胞質(zhì)。為探究 IsA 對鈣離子動員的影響，我們用 Fluo-3AM 標記血小板，隨后檢測在 IsA 和 EGTA 存在時 Ca2+ 熒光強度的變化。調(diào)整基線后，在第 20 秒加入凝血酶，記錄來自致密管系統(tǒng)（DTS）的 Ca2+ 釋放到細胞質(zhì)中的量。當基線平穩(wěn)后，加入 CaCl2，繼續(xù)檢測通過質(zhì)膜進入活化血小板的 Ca2+ 濃度。將平均熒光強度隨時間繪制（圖 5A）。從統(tǒng)計結(jié)果來看，中、高濃度 IsA 顯著抑制了 DTS 中 Ca2+ 的釋放以及血小板外 Ca2+ 的內(nèi)流。總之，IsA 影響了鈣離子動員，包括細胞內(nèi)動員和來自細胞外的內(nèi)流。

3.5. IsA 抑制血小板信號傳導

鑒于 Syk-PLCγ2、PI3K-Akt-GSK3β 和 MAPKs 是血小板激活的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，我們探究 IsA 是否影響這些信號通路的磷酸化。結(jié)果顯示，無論以凝血酶還是膠原為激動劑，IsA 均顯著降低 Syk-PLCγ2、PI3K-Akt-GSK3β 和 ERK1/2 的磷酸化。然而，在凝血酶刺激下，IsA 并未下調(diào) p38 磷酸化，而在膠原刺激的血小板中，p38 磷酸化受到抑制。

3.6. IsA 抑制 FeCl3 誘導的血栓形成

為探索 IsA 的抗血栓特性，我們采用 FeCl3 誘導的頸動脈血栓形成模型進行體內(nèi)研究。經(jīng) IsA（80 mg/kg）處理的小鼠血管阻塞減少，通過蘇木精 - 伊紅（HE）染色對頸動脈血栓進行組織學分析可知。我們發(fā)現(xiàn)，IsA 處理組（40 和 80 mg/kg）小鼠的血管阻塞時間分別為 891.3±129.4 秒和 1125±50.85 秒，與對照組的 287.5±38.13 秒相比顯著延長。這表明 IsA 在體內(nèi)抑制血栓形成。作為陽性對照，阿司匹林也顯著延長了血管阻塞時間，平均時間為 1037±81.13 秒。為分析 IsA 對生理止血的影響，我們在小鼠中進行了尾部出血實驗。出血時間從對照組的 438.2±53.31 秒增加到 20 mg/kg 組的 482.8±44.98 秒和 40 mg/kg 組的 606.4±59.23 秒，但無顯著差異。然而，在最高劑量 80 mg/kg IsA 時，與對照組相比，出血時間顯著延長至 887.5±76.58 秒。80 mg/kg 的阿司匹林也顯著延長了出血時間（798.2±60.78 秒）。總之，IsA 具有抗血栓特性，能延長體內(nèi)血管栓塞時間，但同時伴隨出血風險顯著且可控的增加。

本研究首次發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)中藥毛冬青（Ilex pubescens Hook. & Arn.）的單體成分之一 IsA 能夠抑制血小板激活的多個方面，包括激動劑誘導的血小板聚集、分泌以及整合素 αIIbβ3 的雙向信號傳導。IsA 還能抑制血小板激活過程中鈣離子（Ca2+）的動員以及關(guān)鍵信號分子的磷酸化。此外，IsA 在小鼠體內(nèi)抑制了頸動脈血栓形成。由此得出結(jié)論，IsA 具有抗血小板和抗血栓功能。這一發(fā)現(xiàn)不僅有助于進一步開發(fā)毛冬青（Ilex pubescens Hook. & Arn.）的利用，還為臨床治療血栓性疾病提供了新的解決方案。

血小板激活是一個涉及多個反饋回路的正反饋級聯(lián)反應，是不同通路之間相互作用的動態(tài)過程。在血管損傷部位，血小板黏附于內(nèi)皮下細胞外基質(zhì)，如 von Willebrand 因子（vWF）和膠原。隨后，血小板被激活以釋放或產(chǎn)生 ADP、血栓素 A2（TXA2）和凝血酶。這些受體特異性信號通路作為正反饋介質(zhì)，進一步增加血小板顆粒的分泌、形態(tài)變化，最終導致血小板聚集。在本研究中，IsA 對各種激動劑誘導的血小板聚集表現(xiàn)出更強的抑制作用。

血小板內(nèi)存在三種分泌顆粒：α-顆粒、致密顆粒和溶酶體。α-顆粒含有多種蛋白質(zhì)，如纖維蛋白原、vWF 和血小板因子 4。致密顆粒富含 ADP、ATP、Ca2+ 和 5-羥色胺（5-HT）。溶酶體含有水解酶。流式細胞術(shù)通常通過測量活化血小板中 P-選擇素的暴露來檢測 α-顆粒的釋放。我們的結(jié)果通過測量 ATP 釋放和 P-選擇素暴露，證明了 IsA 對血小板分泌的抑制作用。

整合素通常作為雙向變構(gòu)信號機器（內(nèi)部信號和外部信號）。人類血小板表達多種整合素，包括 α2β1、α5β1、α6β1、αvβ3 和 αIIbβ3。其中，αIIbβ3 是血小板上最豐富的表面受體之一，約占總表面蛋白的 15%。它在靜息血小板中呈不活化構(gòu)象，對血小板執(zhí)行聚集功能至關(guān)重要。受激動劑刺激時，整合素 αIIbβ3 的細胞質(zhì)尾部與細胞內(nèi)蛋白質(zhì)（如塔林和 / 或金德林）相互作用，引發(fā)構(gòu)象變化，通過跨膜區(qū)域傳播，最終導致細胞外結(jié)構(gòu)域的重排。因此，整合素從對配體（包括纖維蛋白原、vWF 和纖維連接蛋白）的低親和力狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楦哂H和力狀態(tài)。這一過程被稱為內(nèi)部信號或整合素 αIIbβ3 激活。FITC-PAC-1 可識別活化的人血小板 αIIbβ3，在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)與 IsA 共孵育后 FITC-PAC-1 的結(jié)合減少，表明 IsA 抑制了 αIIbβ3 的激活。當活化的整合素 αIIbβ3 與纖維蛋白原結(jié)合時，會觸發(fā)細胞內(nèi)信號級聯(lián)反應，也稱為外部信號。這一過程介導穩(wěn)定的血小板黏附、鋪展、血栓回縮和不可逆聚集。一些先前的研究表明，整合素外部信號過程中最早可檢測到的事件之一是特定底物的酪氨酸磷酸化。整合素 αIIbβ3 的細胞質(zhì)尾部具有兩個 NXXY 動機，作為含有磷酸酪氨酸結(jié)合（PTB）結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)的識別位點。這有助于 Src 家族激酶（SFKs）通過其 SH2 結(jié)構(gòu)域與 β3 尾部結(jié)合，啟動下游信號分子的酪氨酸磷酸化，如黏著斑激酶（FAK）。同時，Src 激酶也發(fā)生轉(zhuǎn)自磷酸化。我們的結(jié)果表明，IsA 通過減少外部信號通路中下游信號蛋白的磷酸化，抑制了血小板的黏附、鋪展和血栓回縮。

鈣離子（Ca2+）是一種常見的細胞第二信使，廣泛調(diào)節(jié)基本細胞過程。細胞質(zhì) Ca2+ 是調(diào)節(jié)血小板功能的關(guān)鍵信號機制組成部分，如整合素 αIIbβ3 的激活、TXA2 的合成、顆粒的分泌以及肌動蛋白細胞骨架的重組。細胞質(zhì) Ca2+ 濃度的升高取決于其從致密管系統(tǒng)（DTS）的釋放和通過質(zhì)膜（PM）的細胞外 Ca2+ 內(nèi)流。在本研究中，我們揭示了 IsA 在血小板激活過程中同時抑制了細胞內(nèi) Ca2+ 的動員和細胞外的內(nèi)流。

血小板表達兩種主要的膠原受體：糖蛋白 VI（GPVI）和整合素 α2β1。整合素 α2β1 在促進血小板黏附到膠原方面起著關(guān)鍵作用，而 GPVI 對于膠原激活血小板是必不可少的。這兩種受體協(xié)同工作，傳遞啟動血小板激活的信號。GPVI 在血小板膜上與 FcRγ 鏈形成復合物，其中包含免疫受體酪氨酸激活動機構(gòu)（ITAM）。當膠原與 GPVI 結(jié)合時，ITAM 結(jié)構(gòu)域中的酪氨酸殘基被 Src 家族激酶磷酸化，為下游信號分子提供結(jié)合位點，導致酪氨酸激酶 Syk 的募集和激活。Syk 可以啟動下游信號級聯(lián)反應，進一步激活 PLCγ2，這是 GPVI 信號級聯(lián)反應中的主要效應酶。結(jié)果表明，IsA 減少了 GPVI 下游 Syk 和 PLCγ2 信號分子的磷酸化。我們的研究還發(fā)現(xiàn)，IsA 在凝血酶誘導的血小板激活過程中同樣抑制了 Syk-PLCγ2 的磷酸化。這表明，在膠原和凝血酶誘導的血小板激活中，信號分子下游存在串擾。

磷脂酰肌醇 3-激酶（PI3Ks）是一個包含三種亞型（Ⅰ類、Ⅱ類和 Ⅲ類）的脂質(zhì)激酶家族。Naohide Watanabe 等人指出，Ⅰ類 PI3Ks，尤其是 PI3K P85α，在 GPVI 誘導的下游信號事件中起著關(guān)鍵作用。絲氨酸 / 蘇氨酸激酶 Akt（也稱為蛋白激酶 B）是 PI3K 的關(guān)鍵下游效應因子之一，GSK3β 被認為是在多種細胞類型中 Akt 的主要底物之一。在我們的研究中，我們觀察到 IsA 減少了膠原誘導的活化血小板中 PI3K-Akt-GSK3β 的磷酸化。Susan S. Smyth 等人認為 PI3K-Akt-GSK3β 通路也參與了凝血酶誘導的血小板激活，我們的結(jié)果也顯示磷酸化水平受到抑制。然而，有趣的是，GSK3β 在由凝血酶和膠原誘導的血小板激活中似乎發(fā)揮著相反的作用。當 GSK3β 受到抑制時，凝血酶介導的血小板激活增強，但它卻抑制了膠原刺激的血小板激活。我們的研究結(jié)果表明，當 GSK3β 磷酸化減少時，IsA 抑制了凝血酶誘導的血小板激活。這表明在 IsA 的影響下，GSK3β 的負調(diào)節(jié)作用可能并不顯著，血小板激活仍被有效抑制。

絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）ERK1/2 和 p38 可以在血小板中被多種激動劑激活。我們的數(shù)據(jù)顯示，IsA 抑制了膠原激活的血小板中 ERK1/2 和 p38 的磷酸化，以及凝血酶激活的血小板中 ERK1/2 但非 p38 的磷酸化。這表明 IsA 對血小板的抑制作用可能并不依賴于直接抑制 p38，而是可能通過其他信號通路或分子介導。

在 Saklatvala Jeremy 等人的研究中，p38 被確定為低濃度膠原（1 μg/mL）激活的信號通路中血小板聚集的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。然而，在低濃度凝血酶（1 U/mL）激活的信號通路中，即使存在 p38 抑制劑（如 SB203580），血小板仍然正常聚集。這意味著 p38 在凝血酶誘導的血小板激活中并不起主導作用，而是被其他通路繞過或補償，突顯了凝血酶激活的信號通路的高冗余性。此外，凝血酶通過與 G 蛋白偶聯(lián)受體（PAR 受體）結(jié)合來激活血小板，而膠原則通過與糖蛋白受體（GPVI）結(jié)合來激活血小板。這些受體可能涉及不同的銜接蛋白和激酶來激活下游通路，進一步表明 IsA 可能選擇性地抑制 GPVI 受體下游的信號分子。

綜合這些發(fā)現(xiàn)，IsA 對血小板的抑制作用可能是通過抑制其他關(guān)鍵信號分子（如 Syk-PLCγ2 或 PI3K-Akt-GSK3β）實現(xiàn)的，而不是通過直接抑制 p38。在 GPVI 下游通路中，可能存在特定的信號分子，使得 p38 僅在膠原激活的通路中被磷酸化并被 IsA 抑制。這種選擇性可能反映了 IsA 在調(diào)節(jié)血小板信號傳導中的特定調(diào)控機制。未來的研究可以進一步探討 IsA 在不同激活條件下的機制及其與其他信號通路抑制劑的協(xié)同作用。這將有助于加深對 IsA 作用機制的理解，并為新型抗血小板藥物的開發(fā)提供理論依據(jù)。

在頸動脈血栓模型中，IsA 處理延長了動脈阻塞時間。然而，在尾出血試驗中，我們觀察到高濃度的 IsA 存在尾出血風險。因此，在未來的應用中應避免使用過量的 IsA。總之，IsA 在體內(nèi)對動脈血栓形成具有抑制作用。

【結(jié)論】

我們詳細闡述了 IsA 與血小板功能之間的關(guān)系，并探索了其可能影響的信號機制通路。IsA 不僅影響多種激動劑誘導的血小板聚集和分泌，還抑制了整合素 αIIbβ3 的雙向信號傳導。此外，IsA 還減少了第二信使 Ca2+ 的動員，并降低了多種激動劑的磷酸化水平，包括 Syk-PLCγ2、PI3K-Akt-GSK3β 和 MAPKs，對動脈血栓形成具有抑制作用。綜合來看，這些結(jié)果表明 IsA 有潛力被研究作為一種新型抗血栓藥物。

注：本文原創(chuàng)表明為原創(chuàng)編譯，非聲張版權(quán)，侵刪！

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