CRISPR-Cas9被譽為“分子手術刀”，其高效精準的基因編輯能力已在多種生物體系中廣泛應用。但一個基礎問題至今未解：Cas9為何如此高效，而其“去PAM化”變體（如SpRY）在功能擴展時卻遭遇嚴重效率瓶頸？

2025年4月23，諾貝爾化學獎得主Jennifer Doudna與斯坦福大學Zev Bryant團隊合作（北京大學校友、現任伯克利博士后的史弘略博士作為共同第一作者，主導關鍵生化與動力學實驗設計）在Molecular Cell在線發表了文章Rapid two-step target capture ensures efficient CRISPR-Cas9-guided genome editing，以單分子分辨率揭示Cas9識別基因的動態機制。這一工作不僅揭示了Cas9依賴“精準而適度的PAM識別 + 快速DNA解旋”的兩步機制，更為“是否該不計代價開發去PAM化編輯器”這一行業爭議提供了明確答案。

一、PAM序列：Cas9識別靶標的導航密碼

CRISPR-Cas9的工作機制可類比為在一張復雜的基因組地圖中精準找到一個地址。Cas9能否定位到目標序列，取決于一個小小的“郵編”——PAM序列（Protospacer Adjacent Motif，通常為NGG）。PAM雖然本身并非目標，但它是Cas9啟動搜索的先決條件。

科學界一直試圖擺脫這一限制，開發“去PAM化”的Cas9變體，如SpRY，期望實現對全基因組任意位置的編輯。但這些變體普遍面臨效率下降和脫靶風險增加的問題。正如史弘略博士所說：“這就像把自動駕駛系統的‘車道線’全部抹去，雖然理論上可以走遍所有地方，但車輛更容易迷失方向。”

二、技術突破：兩大利器破解動態謎題

為揭開Cas9效率背后的分子機制，研究團隊結合兩項核心技術：

1. 單分子轉子磁珠追蹤（Rotor Bead Tracking, RBT）

由斯坦福博士生Noor Al-Sayyad開發的RBT技術通過在DNA上連接一個60納米金納米球，實時記錄Cas9蛋白的結合與DNA解旋過程，精度可達單堿基水平。這一“分子攝像機”首次直接觀察到Cas9完成靶點識別和R-loop形成的全過程。

2. 多維度生化系統構建

史弘略博士設計并主導了一整套生化實驗，包括：

· DNA足跡分析：用化學探針描繪Cas9的初始結合的解旋路徑。

· 競爭性結合實驗：模擬細胞中海量非靶DNA競爭環境。

· 人工錯配干預：引入“解旋氣泡”降低能壘，測試Cas9啟動效率。

三、“精準兩步舞”：野生型Cas9的效率秘訣

RBT數據顯示，野生型Cas9之所以高效，在于它的“兩步識別機制”中精密的時間管理：

1. 輕觸PAM，快進快出

Cas9對PAM的親和力適中（Kd約為1 μM），就像“掃地雷”一樣快速掠過潛在位點，識別不合適即刻離開，避免被非特異性序列“纏住手腳”。

2. 閃電解旋，一擊即中

一旦識別到正確的DNA序列，Cas9立即啟動R-loop形成，解開DNA雙鏈的時間不到100毫秒——幾乎與人類眨眼同步，為后續精準剪切贏得寶貴先機。

而SpRY則展現出災難性的動力學失衡：

1. 結合太強，位點太多

SpRY雖然能識別更多PAM序列，但“黏性”太強（結合力是野生型Cas9的100倍），而且幾乎哪兒都能粘上。這導致它到處“徘徊”，在非目標DNA上反復停留，反而迷失方向，錯過真正要剪的靶點。

2. 啟動滯后，效率崩潰

即使SpRY成功抵達目標位點，其解旋過程仍嚴重滯后，常需數十秒才能啟動R-loop形成，遠遠落后于野生型Cas9亞秒級的快速反應，導致整體編輯效率顯著下降。

四、生化實驗證明

為驗證Cas9識別動力學的核心假說，史弘略博士設計并主導了三組環環相扣的實驗，逐步剖析SpRY效率低下的深層原因：

1. DNA足跡實驗：留下“錯誤腳印”

在模擬Cas9初始結合狀態的體系中：

? 野生型Cas9僅在PAM鄰近區域解旋2–3個堿基，精準出手；

? 而SpRY不僅無法有效打開PAM區域，反而在DNA鏈上隨機打開1–2個堿基，動作雜亂、方向迷失。

2. 競爭壓力測試：模擬基因組級混戰

當系統中加入濃度高達目標DNA 400倍的競爭性DNA，模擬真實細胞中海量非目標片段的干擾環境：

? 野生型Cas9憑借“快進快出”的識別邏輯，剪切速率僅略降約1.3倍；

? SpRY則陷入全面癱瘓，剪切活性暴跌200倍，幾乎失去功能。

3. “解旋氣泡”策略：突破能量瓶頸

在目標位點旁人工制造錯配堿基（即“小氣泡”），人為降低DNA解旋的能量壁壘：

? SpRY剪切速率躍升5倍，短暫回歸野生型水平；

? 但在復雜環境下，其活性仍遠遜于Cas9，差距高達30倍。

“這說明問題的根源不是某個單點瓶頸，而是整個識別—解旋過程的動力學耦合被打亂。”史弘略博士總結道。

五、“萬能編輯”是否科學？爭議終結

“我們不該盲目追求去PAM化。”Jennifer Doudna在總結中強調，“未來基因編輯工具應構建一個多樣化的‘PAM工具箱’，為不同臨床或科研需求選擇合適的Cas9變體，而非妄圖以一個萬能工具通吃全場。”

這一觀點為長期以來“是否要犧牲效率換取廣譜性”的爭議畫上句號。

六、技術啟示：單分子技術開啟新篇章

本研究的真正突破，不止在于機制的解析，更在于技術的革命。

傳統生化實驗只能提供群體平均數據，而RBT實現了對單個酶分子的“動態CT掃描”，能夠實時監測結合持續時間、解旋幅度、狀態轉換速度等關鍵參數，為判斷酶活性與脫靶風險提供了強有力工具。

正如Zev Bryant所說：“冷凍電鏡讓我們看清結構，單分子技術則讓我們看懂動作。當我們真正理解分子的行為邏輯，精準治療將成為現實。”

史弘略，共同第一作者，北京大學化學與分子工程學院本科，杜克大學化學系博士，現為加州大學伯克利分校博士后，聚焦CRISPR-Cas系統酶動力學與工具優化。Noor Al-Sayyad與Kevin Wasko為共同第一作者，分別來自斯坦福大學生物工程系與加州大學伯克利分校分子生物學系。Jennifer Doudna，2020年諾貝爾化學獎得主，CRISPR-Cas9基因組編輯技術發明人之一；Zev Bryant，斯坦福大學生物工程系教授，單分子生物物理技術開拓者。

https://doi.org/10.1016/j.molcel.2025.03.024

制版人： 十一

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