作為一個剛入門的科研新手時， 做 PCR 都是師兄師姐把所需引物、試劑拿來，再甩出一個 Protocol，照著程序性加樣、上機就行了，感覺也沒什么技術含量。輪到做自己的課題時，還真是犯了點愁，四處請教，逛論壇看各種帖子，尋找一些設計原則，最后也算形成了自己的一套流程，可以給一些還在迷茫的初學者們一些參考。

下面以（SOD1）為例，一步步演示。

基因序列查找

一般的 PCR 所需序列可以在 NCBI Gene 上，但是甲基化發揮作用主要在啟動子區域，基因序列要包含第一外顯子的上游堿基，所以查找基因序列可以用 UCSU 的 Genome Browser（http://genome.ucsc.edu/）。

點擊 Genomes 選擇對應的染色體標本

輸入基因名稱

選擇基因轉錄本

注意一個基因可能有多個轉錄本，在 RefSeq Genes 里選擇你要查找的序號。

查看基因序列

設置參數

點擊 submit 便出現了外顯子大寫的的基因序列，可 copy 到 word 里保存供以后參考。

在線設計引物

利用甲基化設計的網站 Meth Primer（http://www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi1）粘貼基因序列。

粘貼基因序列

包含第一外顯子和上游堿基的基因序列。

設置條件

查看結果

網站給出的幾個參考的引物相差不大，可以根據自己的需要重新設置條件來重新設計。另外可以根據一些設計引物的原則來篩選合適的引物。我也整理了一些關于引物設計的原則，供參考。

網站給出的幾個參考的引物相差不大，可以根據自己的需要重新設置條件來重新設計。另外可以根據一些設計引物的原則來篩選合適的引物。我也整理了一些關于引物設計的原則，供參考。

參考原則

確保目標序列中有非 CpG 的 C 的個數。

如果你沒有足夠的 C 位于非 CpG 內，那么未轉化的 DNA 和甲基化的 DNA 看上去會差不多，以 6～7 個 CpG 為理想。如果低于這個，那么特異性會降低。你會得到非特異性的擴增，因為它區分度不夠。

讓產物短一點

亞硫酸氫鹽轉化的過程會損傷模板 DNA，因此嘗試擴增較小的片段（小于 150 bp），將得到最佳的結果。如果你通過電泳來運行產物，那么確保你能夠將 M 引物的產物與 U 引物的分開。

遵守 PCR 的原則 PCR 引物設計的所有原則也適用于 MSP。

1）引物的退火溫度要相當，如果可以的話，將 M 引物和 U 引物設計成相同的條件，這樣可同時運行。

2）引物之間不要形成二聚體，一般引物自身連續互補堿基不大于 3 bp。

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