撰文 | 風

免疫治療如細胞過繼療法（adoptive cell therapy，ACT）和免疫檢查點阻斷（immune checkpoint blockade，ICB）給腫瘤治愈帶來新的希望。CD8+ T細胞介導的細胞免疫應答促進腫瘤細胞的清除。IFNγ可以通過促進抗原提呈和誘導細胞因子以及趨化因子的產生增強免疫細胞浸潤并重塑腫瘤微環境（tumour microenvironment，TME）。因此，IFNγ信號通路對于ACT和ICB的免疫治療成功至關重要。在大部分實體瘤中，免疫治療并不能取得長期的效果，這部分與IFNγ通路相關基因的功能缺失突變有關【1,2】。目前仍不清楚大部分腫瘤細胞如何逃避免疫監視，靶向干預腫瘤細胞對IFNγ和CD8+ T細胞的細胞毒作用的耐受機制是誘導有效抗腫瘤效應和最大化腫瘤免疫治療效果的關鍵。研究表明腫瘤細胞和免疫細胞之間的營養競爭和代謝交流誘導免疫逃逸【3-6】。靶向腫瘤代謝相關通路如氧化磷酸化和自噬可以促進抗腫瘤免疫【7,8】。然而，目前對腫瘤細胞介導免疫逃逸的分子或通路，尤其是代謝相關的分子和通路仍缺乏系統性理解。

近日，圣裘德兒童研究醫院免疫系遲洪波團隊在Nature上發表了文章VDAC2 loss elicits tumour destruction and inflammation for cancer therapy。該文章通過CRISPR篩選新的腫瘤免疫逃逸分子-VDAC2，靶向敲除VDAC2促進BAK激活誘導的細胞死亡和I型IFN反應介導的免疫活化，進而實現良好的抗腫瘤效果。

為了鑒定與腫瘤細胞免疫逃逸相關的重要代謝因子，作者基于B16-OVA和OT-I系統使用CRISPR-Cas9技術在體內和體外篩選3017個代謝相關的基因，分析發現在體內外免疫壓力中均發現Vdac2是B16-OVA細胞免疫逃逸相關的重要基因。作者選取不同序列的靶向Vdac2的sgRNA序列以及選用M38-OVA細胞模型在體內外（腫瘤細胞與）進一步證實腫瘤細胞敲除Vdac2對OT-I T細胞殺傷更為敏感。敲除Vdac2也能改善腫瘤細胞的ICB治療（anti-PD-1或anti-PD-L1）效果。此外，敲除Vdac2緩解轉移瘤并顯著延長生存期。考慮到TNFα不響應是ICB治療的障礙，作者同時刪除Vdac2和Tnfrsf1a發現Vdac2敲除也能改善TNFα不響應腫瘤細胞對ICB的治療效果。總之，這些數據表明靶向VDAC2是克服腫瘤細胞免疫逃逸和增強抗腫瘤免疫應答的有效方法。

為了進一步闡釋VDAC2缺失改善CD8+T細胞殺傷的機制，作者將Vdac2缺陷B16-OVA與perforin-、IFNγ-或TNF-缺失的OT-I T細胞共培養發現只有IFNγ缺失減弱VDAC2缺失引起的CD8+T細胞殺傷敏感性。與此同時，封閉抗體和Ifngr1聯合敲除也進一步證實IFNγ而非TNFα誘導Vdac2缺失腫瘤細胞的死亡。機制上，Vdac2缺失并沒有增強經典的IFNγ-STAT1信號通路，而是增加IFNγ誘導的caspase-3、caspase-7和GSDME的激活。同時，caspase-3、caspase-7或GSDME敲除均可以減弱Vdac2缺失引起的IFNγ殺傷作用。類似的，凋亡抑制劑而非鐵死亡、壞死和焦亡抑制劑降低Vdac2缺失引起的IFNγ殺傷作用，提示VDAC2缺失促進IFNγ誘導的細胞凋亡和繼發性壞死介導的細胞死亡。既往研究指出靶向PTPN通過增強IFNγ通路改善免疫治療。相比于任何單一基因缺失，同時敲除PTPN和VDAC2進一步增強IFNγ誘導的細胞死亡，提示PTPN和VDAC2是聯合治療的有效分子靶點。

隨后，作者使用scRNA-seq分析VDAC2缺失對B16-OVA腫瘤的免疫（CD45+）和非免疫（CD45-）細胞的影響。scRNA-seq和流式細胞術均發現VDAC2缺失顯著促進免疫細胞中CD8+T細胞浸潤，尤其增加CD8/Treg比例。與此同時，VDAC2缺失改善浸潤CD8+T細胞的效應功能，表現為克隆擴增和效應分子（IFNγ、TNFα和GZMB）表達增加以及耗竭T細胞比例降低。另外，數據庫分析表明人多種腫瘤VDAC2表達水平與炎癥和T細胞相關基因特征有關。因此，腫瘤細胞VDAC2缺失重塑TME，尤其激活CD8+T細胞介導的抗腫瘤免疫。IFNγ中和抗體處理顯著抑制VDAC2缺失引起的免疫細胞浸潤和CD8+T細胞效應功能，導致腫瘤控制效果減弱，說明IFNγ介導VDAC2缺失時TME的重塑。scRNA-seq分析表明免疫細胞中的CD8和NK細胞IFNγ表達最多，但CD8 T細胞數量最多。CD8 T細胞IFNγ敲除出現IFNγ中和抗體類似的表型，提示CD8+T細胞來源IFNγ介導VDAC2缺失的TME重塑。

scRNA-seq分析以及VDAC缺失B16-OVA經IFNγ處理的轉錄組測序均發現I型IFN反應增強。IPA分析也表明STING、IRF3和IRF7活性增加。WB也證實IFNγ顯著上調VDAC缺失細胞STING及其磷酸化、TBK和IRF3的磷酸化水平，提示VDAC2限制IFNγ誘導的STING活化。值得注意的是，同時敲除VDAC2和STING相關基因（Cgas、Sting1或Irf3）雖然顯著降低I型IFN反應但并不影響IFNγ引起的VDAC2缺失細胞死亡表型。考慮到VDAC2是線粒體蛋白，作者假設VDAC2缺失促進線粒體DNA釋放誘導STING通路激活。實驗證實IFNγ顯著促進VDAC2缺失細胞中mtDNA的堆積。腫瘤細胞缺失mtDNA（ρ0）抑制IFNγ誘導的VDAC2敲除細胞STING活化。總之，異常胞質線粒體DNA介導IFNγ誘導的VDAC2敲除細胞cGAS-STING和I型IFN反應。

為了進一步鑒定VDAC2缺失對IFNγ誘導細胞死亡敏感性增強的機制，作者在VDAC缺失B16-OVA細胞中再次行CRISPR篩選，結果發現靶向Casp9和Bak1（編碼BAK）敲除在緩解VDAC2缺失介導的腫瘤細胞死亡的效果最好。BAK和BAX通過促進線粒體外膜滲透和細胞色素c釋放調節線粒體依賴的細胞死亡。敲除Bak1而非Bax抑制IFNγ在VDAC2缺失腫瘤細胞誘導的細胞死亡。此外，敲除Bak1抑制IFNγ在VDAC2缺失腫瘤細胞誘導的胞質mtDNA堆積和cGAS-STING活化。機制上，VDAC2可以直接結合并抑制BAK。VDAC2缺失促進BAK的異常激活，尤其是在IFNγ刺激時，引起下游線粒體外膜滲透增高以及細胞色素c的釋放。突變對于與BAK結合的VDAC2重要位點可以模擬BAK聯合敲除表型，提示VDAC2與BAK結合在抑制IFNγ刺激的重要性。在體內，Bak1和VDAC2聯合敲除顯著逆轉VDAC2敲除引起的抗腫瘤表型。令人振奮得是，IFNγ并不能在VDAC2缺失的正常細胞誘導細胞死亡，這種不同可能與IFNγ在正常細胞和轉化細胞引起的BIM、BID和BAK表達差異有關。總之，VDAC2敲除具有良好的抗腫瘤臨床轉化價值。

綜上所述，這項研究通過CRISPR篩選技術鑒定VDAC2作為介導腫瘤細胞免疫逃逸的關鍵分子，靶向VDAC2誘導腫瘤細胞對CD8+ T細胞和IFNγ治療的敏感性。機制上，VDAC2缺失促進BAK激活導致細胞色素c和mtDNA釋放，分別誘導細胞死亡和cGAS-STING激活介導的免疫活化。該研究為腫瘤的免疫逃逸和免疫治療提供新的理解和靶點。

https://doi.org/10.1038/s41586-025-08732-6

制版人： 十一

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