革蘭氏陰性菌外膜囊泡（outer membrane vesicles, OMVs）是來源于細菌外膜的納米級結構，近年來被認為在宿主-病原體互作中發揮關鍵作用。然而，由于其在復雜生物樣本中難以識別，OMVs作為生物標志物的潛力仍未被充分挖掘。南方醫科大學附屬南方醫院檢驗科、廣東省精準醫學應用學會細胞外囊泡分會主任委員鄭磊，南方醫科大學附屬南方醫院檢驗科、廣東省精準醫學應用學會細胞外囊泡分會副主任委員司徒博，南方醫科大學附屬南方醫院檢驗科歐子豪在本研究中提出一種利用多黏菌素B-熒光探針（Polymyxin B-fluorescein，PmBF）檢測和定量血液中細菌來源OMVs的新方法。該探針可特異性識別細菌脂多糖（lipopolysaccharides，LPS），從而選擇性地標記OMVs，實現其與宿主來源的外泌體的區分，并可通過納米流式細胞術（nano-flow cytometry）進行定量分析。在雄性小鼠肺炎模型中，研究者發現血清中PmBF陽性外泌體（PmBF? EVs）在感染后6小時即顯著升高，早于血液培養結果。在臨床樣本中，PmBF? EVs在細菌感染的診斷中表現出優越性能，且可有效區分細菌感染與病毒或支原體感染。研究結果表明，循環中的PmBF? EVs有望成為細菌感染的潛在生物標志物。相關研究以Specific labeling of outer membrane vesicles with antibiotic-conjugated probe reveals early bacterial infections in blood發表在Nature Communications上。

研究背景

細菌感染仍是全球范圍內導致發病率和死亡率的重要原因，尤其是大腸桿菌（Escherichia coli）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）和銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）等革蘭氏陰性菌，占據了2024年世界衛生組織公布的細菌重點關注病原體名單的大部分。及時且準確的診斷對于優化患者預后和合理使用抗生素至關重要。然而，目前常用的診斷生物標志物仍存在顯著局限性。諸如C反應蛋白（CRP）和降鈣素原（PCT）等宿主反應標志物往往缺乏針對細菌感染的特異性，且在感染早期或局灶性感染中可能未明顯升高。此外，這些標志物在非細菌性感染，如病毒感染、支原體感染以及其他非感染性炎癥狀態下亦可能升高，進一步限制了其診斷價值。

相比之下，病原體來源的標志物（如細菌抗原和核酸）雖然具有更高的特異性，但在感染早期或細菌負荷較低的情況下敏感性不足。同時，這類標志物也難以準確區分活躍感染與單純定植。因此，開發更具精準性的診斷標志物迫在眉睫。

革蘭氏陰性菌外膜囊泡（outer membrane vesicles, OMVs）是來源于細菌外膜的納米級、雙層膜結構。這些囊泡在細菌正常生長過程中以及應對環境應激時主動釋放，內含多種生物活性成分，包括蛋白質、脂質、核酸和毒力因子。越來越多的研究表明，OMVs在細菌生理調控、致病過程及細胞間通信中發揮重要作用。例如，OMVs可介導水平基因轉移，促進生物膜形成，并增強細菌在不利環境下的存活能力。此外，OMVs還通過向宿主細胞遞送細菌效應分子、激活先天免疫反應并誘發炎癥，調節宿主-病原體互作過程，凸顯其在細菌感染發病機制中的潛在作用。已有研究甚至發現OMVs可在細菌感染部位聚集。然而，OMVs與細菌感染的直接關聯性及其作為臨床生物標志物的應用價值仍有待進一步闡明。

分析宿主生物樣本中的OMVs是研究其生物學功能并驗證其生物標志物潛力的前提。然而，目前尚缺乏理想的方法。一方面，體液中宿主來源的外泌體數量遠多于細菌OMVs，且兩者在理化性質上高度相似，極難區分；另一方面，OMVs在體液中含量本就極低，檢測分析需具備極高靈敏度。此外，血液中還存在大量粒徑相似的雜質成分，尤其是在疾病狀態下，如脂蛋白等，會引發干擾信號，影響結果準確性和臨床解釋。因此，需開發新的工具和策略以突破復雜樣本背景對OMVs研究的限制，從而系統解析其在細菌感染中的功能和機制。

為應對上述挑戰，研究者在本研究中開發了一種基于抗生素-熒光探針（Polymyxin B-FITC，PmBF）的新型方法，能夠在復雜生物樣本中高特異性、高靈敏度地檢測和定量細菌來源的OMVs。利用該策略，研究者在細菌感染早期即觀察到循環系統中存在細菌OMVs，其檢出陽性率高于常規血培養，提示其作為細菌感染早期生物標志物的潛在價值。本研究成果不僅為宿主-病原體互作機制的深入理解提供了新視角，也為細菌感染的早期精準診斷提供了新的解決路徑（見Fig. 1）。

實驗結果1

PmBF可特異性識別并定量檢測細菌OMVs

實現OMVs與宿主來源外泌體（EVs）之間的準確區分是精確分析OMVs的前提。為應對這一挑戰，研究者嘗試篩選一種能高度特異識別細菌結構的分子。由于抗生素在識別微生物細胞方面具有高度特異性，研究者認為其為理想候選。通過初步文獻調研，研究者確定多黏菌素B（Polymyxin B，PmB）為最具潛力的分子。PmB是一種由Paenibacillus polymyxa分泌的環狀陽離子多肽抗生素，可通過結合革蘭氏陰性菌外膜上的脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）發揮抗菌作用。基于該特性，研究者在其N端接入異硫氰酸熒光素（FITC），合成熒光探針PmB-FITC（PmBF）。

經MALDI-TOF質譜分析（Supplementary Figs. 1a–c）證實PmB與FITC成功偶聯，熒光檢測及吸收光譜分析（Supplementary Fig. 1d）表明FITC標記后的PmBF仍保持良好熒光性能。隨后，研究者對PmBF的殺菌活性進行了評估，結果顯示其抗菌能力相較原始PmB有所降低（Supplementary Fig. 1e），可能因FITC修飾引起PmB構象變化，影響其插入細菌膜的能力。

為驗證PmBF的靶向特異性，研究者將其分別與革蘭氏陰性菌E. coli、革蘭氏陽性菌S. aureus和哺乳動物細胞HeLa共孵育。超分辨成像（Fig. 2a）和共聚焦圖像（Supplementary Fig. 2）顯示，PmBF信號僅與E. coli共定位，而在S. aureus與HeLa中未見明顯信號。熒光強度定量分析（Fig. 2b）進一步驗證了PmBF對E. coli的特異性識別能力。

為了明確PmBF是通過識別LPS實現靶向，研究者使用LPS特異性抗體對E. coli進行預處理以阻斷LPS，隨后進行PmBF標記。熒光成像結果（Supplementary Fig. 3）顯示阻斷后熒光顯著減弱，證實PmBF結合E. coli依賴于其與LPS的特異性相互作用，也表明其可用于識別同樣含LPS的OMVs。

研究者進一步探討了PmBF對OMVs的識別能力。通過超速離心法分別從E. coli、S. aureus和HeLa培養液中提取EVs，并采用納米顆粒跟蹤分析（NTA）、蛋白免疫印跡（WB）和透射電子顯微鏡（TEM）進行表征。NTA數據顯示，三類EV的平均粒徑分別為94.7 nm、112.4 nm和103.5 nm（Fig. 2c，Supplementary Figs. 4a, b）；WB檢測發現，E. coli來源OMVs表達OmpA與LPS，S. aureus EVs表達LTA，HeLa EVs表達TSG101與CD81（Fig. 2d，Supplementary Figs. 4c, d，Supplementary Fig. 12）；TEM圖像顯示EVs均呈典型球形結構（Fig. 2e，Supplementary Figs. 4c, d），表明EVs成功提取。

為評估PmBF與OMVs的結合能力，研究者使用CellMask? Deep Red預染EVs膜結構后與PmBF共孵育，并進行超分辨成像。結果顯示，PmBF信號與E. coli OMVs共定位明顯，而在S. aureus與HeLa EVs中無明顯信號（Fig. 2f，Supplementary Fig. 4e），證實PmBF可特異性識別E. coli來源OMVs。

為實現對PmBF標記OMVs的定量分析，研究者引入了納米流式細胞術（nano-flow cytometry，Fig. 2g），可用于分析粒徑在40–1000 nm范圍內的顆粒。該平臺能有效區分EVs與膜碎片等雜質，后者是潛在的假陽性來源。研究者使用Triton X-100處理E. coli OMVs，獲得囊泡碎片樣品，檢測結果顯示其信號顯著低于天然OMVs，粒子數量減少約7.78倍（Fig. 2h, i），說明該平臺具備良好抗雜質干擾能力，適用于OMVs定量檢測。

目前已知OMVs廣泛存在于人體體液中，并參與多種生物學過程，但關于其在體液中的濃度數據仍較有限。以往研究多采用ELISA、WB或LAL法檢測OMVs中LPS含量，無法直接反映顆粒濃度。研究者前期研究發現，健康成人血清中OMVs約占EVs總量的3–4%，約為3 × 10?至4 × 101?顆粒/mL；革蘭氏陰性菌培養上清中OMVs濃度約為3.26 × 1012顆粒/mL。在本研究中，納米流式平臺最低可檢測濃度為2 × 10?顆粒/mL（Fig. 2j），而WB僅在OMVs濃度超過2 × 10?顆粒/mL時出現條帶（Supplementary Fig. 5a），顯示該平臺具備高靈敏度，適用于OMVs檢測。

為優化PmBF標記濃度，研究者設定不同濃度對E. coli OMVs進行標記（Supplementary Fig. 5b），結果顯示，當PmBF濃度高于5 μM時，陽性標記率趨于穩定。綜合考慮標記效率與非特異結合，研究者最終選定5 μM作為后續實驗的標準使用濃度。

隨后，研究者拓展檢測對象，包括哺乳動物細胞、革蘭氏陰性菌及革蘭氏陽性菌來源的EVs，均進行PmBF標記后使用納米流式檢測（Fig. 2k）。結果顯示，OMVs的標記效率顯著高于其他EVs：E. coli（37.53%）、K. pneumoniae（40.50%）、A. baumannii（39.73%）；而HeLa（3.07%）、S. aureus（2.93%）與S. epidermidis（3.07%）較低，可能源于非特異吸附。這進一步確認PmBF結合OMVs具備良好特異性，且可實現定量分析。

為進一步驗證PmBF的特異性，研究者考察其在血脂類干擾背景下的識別能力。結果顯示，與LPS抗體檢測相比，PmBF與陰性對照組（VLDL液）標記率相近，均顯著低于LPS抗體組（Fig. 2l），提示PmBF對脂蛋白等非特異性干擾具較強抵抗力。

最后，研究者將E. coli OMVs與HeLa或S. aureus EVs按不同比例混合，構建6種模型（HeLa組、S. aureus組、EHS組、EH組、ES組、E. coli組），檢測各組中OMVs的標記情況（Fig. 2m）。結果顯示，不論OMVs比例如何變化，該方法均能準確反映OMVs相對比例，回收率穩定，進一步驗證了該方法在混合EV樣本中具有良好的靈敏度與特異性，證實PmBF具備高效識別OMVs的能力，且能抵抗脂蛋白與其他EVs干擾。

實驗結果2

PmBF標記過程保留了OMVs的完整性與生物活性

在標記過程中維持OMVs的物理、化學及功能完整性，是可靠研究其在多種生理與病理過程中的作用的基礎。為驗證PmBF在OMVs研究中的適用性，研究者對其生物相容性進行了系統評估，重點考察其對OMVs天然性質與功能的保持能力。

首先，研究者評估了標記過程是否影響OMVs的基本特性，包括粒徑、濃度和形貌。NTA和TEM結果顯示，PmBF標記不會改變OMVs的粒徑分布及球形形貌（Supplementary Fig. 6a–c），推測與PmBF分子量較小有關，可在不引發顯著結構擾動的情況下實現高效標記。此外，研究者評估了PmBF-OMVs在貯存過程中的穩定性。結果表明，PmBF-OMVs在4°C條件下貯存7天后，粒徑與濃度未出現明顯變化，與未標記OMVs相當（Supplementary Fig. 6d, e），提示標記過程未破壞OMVs的物理結構。進一步地，研究者檢測了PmBF標記的熒光穩定性，在7天內熒光強度波動極小（Supplementary Fig. 6f），表明PmBF具備良好的標記穩定性。

在蛋白質組層面，Western blot分析顯示，PmBF標記不會改變OMVs的蛋白質組成（Supplementary Figs. 6g 和 12）。考慮到PmB主要通過與革蘭氏陰性菌LPS的負電荷區域結合發揮作用，研究者進一步檢測了標記前后OMVs的zeta電位。結果顯示，PmBF標記不會顯著改變OMVs的zeta電位（Supplementary Fig. 7a）。進一步地，在細菌水平上進行相同檢測，也未觀察到PmBF在標記濃度下對細菌zeta電位的顯著影響（Supplementary Fig. 7b）。為排除FITC標記對上述現象的潛在影響，研究者使用不同濃度的PmB與PmBF處理E. coli，結果顯示，無論濃度如何變化，均未顯著影響細菌濃度（Supplementary Fig. 7c），進一步證實PmBF探針在實驗條件下對OMVs及細菌的結構完整性影響甚微。

在生物活性方面，研究者評估了OMVs對BEAS-2B細胞增殖的影響。結果顯示，自然OMVs與PmBF-OMVs在共孵育12 h與24 h后對細胞增殖的作用相當（Supplementary Fig. 7d）。為進一步觀察標記是否影響OMVs與細胞的相互作用，研究者使用CellMask? Deep Red膜染料分別對自然OMVs與PmBF-OMVs進行染色，并觀察其細胞攝取情況。結果顯示，兩者在3 h與24 h后均被細胞成功攝取，熒光圖像（Fig. 3a，Supplementary Fig. 7e）及定量熒光分析均顯示無顯著差異，提示標記不影響細胞攝取效率。

進一步地，研究者考察了PMBF標記是否影響OMVs的細胞內分布。分別對細胞內不同胞器進行染色并與攝取后的OMVs進行共定位分析（Fig. 3b，Supplementary Fig. 7f），結果發現OMVs主要定位于溶酶體區域，且PmBF-OMVs與自然OMVs的分布模式一致。盡管當前實驗條件尚無法精準解析PmBF標記對具體攝取通路的影響，但總體內吞水平未受顯著影響，提示包括受體介導的內吞在內的主要內吞機制未被實質性抑制。

此外，為進一步評估PmBF標記對OMVs生物學功能的影響，研究者采用創傷愈合劃痕實驗對其調控細胞遷移能力進行評估。此前已有研究表明OMVs可調節細胞遷移，且該實驗可提供簡潔量化的功能性評價指標。結果顯示，在所有檢測濃度下，PmBF-OMVs與自然OMVs對BEAS-2B細胞遷移速率的影響無顯著差異（Fig. 3c），提示PmBF標記不會損害OMVs的遷移調控能力。

綜上結果，研究者系統地驗證了PmBF標記過程在物理結構、生物組成、細胞攝取及生物功能等多個層面均具良好穩定性與非干擾性，進一步確認該探針在OMVs功能研究及生物標志物開發中的廣泛適用性。

實驗結果3

循環OMVs可作為細菌感染的早期標志物

已有研究證實，小比例的細菌來源OMVs可存在于小鼠和人類的血清中。為驗證本研究開發的基于抗生素的熒光探針是否能夠檢測血清中的OMVs，研究者選擇無菌（GF，無任何細菌定植）雄性小鼠與特定病原體陰性（SPF，具有正常腸道菌群）雄性小鼠作為模型。理論上，GF小鼠體內不存在細菌，因此可作為背景對照。檢測結果顯示，SPF小鼠血清中平均4.80%的EVs為PmBF陽性，而GF小鼠中該比例為1.97%，差異顯著（Fig. 4a）。為進一步驗證該差異是否源于小鼠體內細菌的存在，研究者給予小鼠廣譜抗生素以清除體內細菌（Fig. 4b），糞便菌落計數顯著下降（Supplementary Fig. 8a），表明抗生素處理有效。處理后的小鼠血清中PmBF陽性EV比例下降至2.03%（Fig. 4c），接近GF小鼠水平。這些結果表明該探針可有效識別血清中細菌來源OMVs，且其存在與體內細菌負荷密切相關。

進一步地，研究者在細菌感染模型中驗證了該相關性。通過鼻內滴注大腸桿菌（E. coli）或肺炎克雷伯菌（K. pneumoniae）建立雄性小鼠肺部感染模型（Fig. 4d），并在感染后的多個時間點收集血液樣本進行細菌培養及血清EVs檢測。在E. coli感染組中，血清中PmBF? EVs的水平在感染后6、12、24小時均顯著升高（Figs. 4e, f），而細菌培養在6小時時僅有1只小鼠陽性。各時間點的PmBF? EV陽性率均高于血液培養（Fig. 4g）。常用炎癥標志物CRP和PCT則表現出不一致的變化趨勢（Supplementary Figs. 8b, c），其中PCT在6、12、24小時無顯著升高，CRP在12小時時亦未顯著升高。類似地，在K. pneumoniae感染模型中，PmBF? EVs在感染后6、12、24小時均呈升高趨勢，而血液細菌培養均為陰性（Supplementary Figs. 8d–f）。為評估PmBF對革蘭氏陰性細菌感染的特異性，研究者建立了由革蘭氏陽性細菌肺炎鏈球菌（S. pneumoniae）引發的感染模型，在感染12小時后檢測血清EVs，結果顯示PmBF? EVs水平并未變化（Supplementary Fig. 8g），進一步支持了PmBF在識別革蘭氏陰性菌感染中的特異性。

為探究不同細菌負荷對循環OMVs水平的影響，研究者以不同濃度細菌感染小鼠，檢測其血清OMVs含量。結果發現，當細菌負荷達到8 × 10? CFU時，部分小鼠循環OMVs水平開始出現平臺期；而在8 × 10? CFU以下時，其水平與未感染對照組相近（Supplementary Fig. 8h）。

為明確血液中升高的PmBF? EVs是否來自感染部位的細菌，而非由于腸道屏障損傷導致的OMVs泄漏，研究者構建了表達mCherry-OmpA融合蛋白的大腸桿菌菌株。相比野生型，mCherry標記菌株具有更強的紅色熒光信號（Supplementary Fig. 9）。進一步實驗表明，該菌株分泌的OMVs中可檢測到mCherry信號（Fig. 4h）。在肺部感染模型中，經鼻注入mCherry-E. coli后，在感染6小時血清中可檢測到平均8.2%的mCherry?囊泡，顯著高于PBS處理組（Fig. 4i），而血液培養中未檢出可存活的mCherry菌株（Fig. 4j）。這些結果證實循環中升高的PmBF? OMVs主要來源于感染部位的致病菌，支持其作為敏感感染標志物的潛力。

為進一步驗證循環OMVs水平能否反映感染動態變化及治療應答，研究者對感染小鼠進行抗生素干預，并動態監測OMVs水平變化。結果顯示，感染后6小時血清OMVs開始升高，12小時達到峰值，提示活躍感染狀態；隨后給予抗生素治療，OMVs水平逐漸下降，至36–48小時回落至正常水平（Fig. 4k）。這一趨勢說明循環OMVs水平可動態反映感染進程及治療效果，具有潛力作為療效評估的生物標志物。

此外，為驗證早期診斷在治療中的重要性，研究者設定不同時間點開始抗生素干預，并每12小時給予一次，記錄生存率（Fig. 4l）。結果顯示，延遲治療組在32小時生存率下降至30.8%，而早期治療組生存率提升至76.9%（Fig. 4m），表明早期干預對預后具有顯著改善作用。值得注意的是，在該肺部感染模型中，PmBF? EVs可在感染后6小時即被檢測到，早于血液細菌培養陽性和炎癥指標顯著升高的時間點。這一發現強調了PmBF? EVs在早期診斷和治療決策中的潛在價值，有望顯著改善感染性疾病的臨床結局。

實驗結果4

PmBF? EVs作為細菌感染生物標志物的臨床應用價值

為評估PmBF? EVs作為細菌感染生物標志物的臨床潛力，研究者分析了來自健康人群與細菌感染患者的血清樣本，其中細菌感染患者包括血流培養陰性（BI）與陽性（BSI）兩類（Fig. 5a，Supplementary Table 1）。血清EVs經納米顆粒跟蹤分析（NTA）、蛋白免疫印跡（WB）和透射電鏡（TEM）進行表征（Supplementary Figs. 10 和 12）。如Fig. 5b所示，細菌感染患者血清中PmBF? EVs水平較健康對照顯著升高（平均7.90% vs. 4.00%），且BSI患者水平（平均9.61%，范圍5.00–15.90%）高于BI患者（平均6.75%，范圍0.70–16.50%），提示PmBF? EVs水平與感染嚴重程度之間可能存在關聯。

為進一步評估PmBF? EVs的診斷效能，研究者進行了受試者工作特征曲線（ROC）分析。結果顯示，對于所有細菌感染及血流感染患者，PmBF? EVs的曲線下面積（AUC）分別為0.817與0.974（Fig. 5c, e）。值得注意的是，將PmBF? EVs與PCT及CRP聯合使用可進一步提升診斷AUC值，尤其在血流感染診斷中表現更加突出（Fig. 5d, f）。

此外，研究者還探討了PmBF? EVs在細菌感染與病毒或支原體感染的鑒別診斷中的潛力（Fig. 5g，Supplementary Table 1）。結果表明，細菌感染患者血清中循環PmBF? EVs水平顯著高于病毒或支原體感染者（Fig. 5h）。ROC分析結果顯示，PmBF? EVs在細菌感染與病毒感染之間的AUC為0.817，在細菌感染與支原體感染之間的AUC為0.840（Fig. 5i, k）。進一步將PmBF? EVs與PCT和CRP聯合分析后，AUC分別提升至0.949和0.959，顯示出其在細菌感染鑒別診斷中的顯著應用潛力。

綜上，研究者結果表明PmBF? EVs可作為反映感染程度、支持早期診斷及與其他感染性疾病進行鑒別的有效生物標志物，在臨床感染管理中具有重要價值。

總結

總而言之，研究者開發出一種可用于復雜生物樣本中特異性檢測與定量OMVs的新策略。該方法結合了基于多黏菌素B（PmB）的熒光探針與先進的納米顆粒分析技術，成功揭示了在動物模型和人類患者血液樣本中存在OMVs，表明其在細菌感染早期具有潛在的生物標志物價值。研究結果發現，在感染初期循環中的PmBF? EVs水平顯著升高，早于傳統診斷標志物的變化。

具有重要臨床意義的是，研究者進一步證實循環中的PmBF? EVs可作為細菌感染早期診斷與鑒別診斷的有力生物標志物。因此，該檢測方法不僅為深入理解細菌感染提供了有效平臺，也有望在臨床實踐中提升感染性疾病的診斷與管理水平。

來源：生物納米研究