好書推薦！《動物行為實驗指南》電子版pdf，網盤發貨

《動物行為實驗指南》共674頁，涵蓋了常見的實驗動物，如小鼠、大鼠和斑馬魚，詳細描述了每一種行為測試的實驗設計、測試設備、實驗流程、評估指標、預期結果、常見問題及解決方法、數據分析、模型應用與局限性等各個方面。它通過快速引導，幫助研究人員高效地掌握實驗的每個階段，減少了查閱文獻和尋找方法的時間，成為各類科研人員的重要參考資料。 《動物行為實驗指南》共計收錄了16種動物行為類型，包括焦慮抑郁、學習記憶、痛覺、運動、恐懼、社交、癲癇、操作、成癮、視覺、癢覺、味覺、嗅覺、睡眠、斑馬魚行為以及常見動物模型等內容。每一類動物行為下，都詳細介紹了多個經典的實驗范式，涵蓋了超過100種實驗方法。 www.behaviewer.com

在CNS中，Ca2+是電流的載體，更是一種重要的第二信使，它幾乎參與了所有的細胞分子事件。細胞的膜系統有一系列與Ca2+調控密切相關的蛋白質，它們既保證Ca2+發揮相應的生理功能，又能夠維持細胞內、外Ca2+的內穩態平衡。神經元在靜息狀態下，細胞內、外游離Ca2+的濃度十分懸殊，組織液中Ca2+的濃度大約為幾mM/L，而胞內游離Ca2+的濃度僅為100nM/L左右；當神經元產生動作電位時，胞外大量的游離Ca2+通過細胞膜上的相關通道和受體涌入胞內，產生鈣瞬變。鈣瞬變可以真實反映神經元的動作電位活動，因此，監測胞內游離Ca2+的濃度變化，就能記錄神經網絡中神經元的活動信息。

光纖植入與鈣信號記錄方法在等待留針的過程中可進行光纖端面的處理：用光纖剝除工具將光纖尾端約15mm處的保護套和涂覆層剝除，只留下纖芯部分；將點膠針頭（不銹鋼針頭長13mm，內、外徑分別為0.3±0.1mm和0.56mm±0.1mm）的金屬針頭部分作為金屬套管套在纖芯部分并用萬能強力膠固定，隨后用紅寶石光纖刻劃刀切割纖芯，使金屬套管前端留出足夠深入動物腦組織的長度的纖芯。用萬能強力膠將金屬套管的后端粘在光纖的保護層上，可以有效避免動物自由活動時折斷光纖。光纖的另一端時FC/PC接頭，連接在光纖光度檢測裝置上，在處理后的光纖尾端被植入腦組織之前，打開裝置光源，觀察光纖尾端端面的出光情況，同時確認光纖端面的光功率在50~100μW的范圍內（實驗過程中可根據鈣信號基線走勢判斷光漂白作用是否嚴重，若基線下降明顯，可根據提前測試好的裝置光源與光纖端面光功率的比值，適當降低裝置光源的光功率），隨后關閉裝置光源。輕輕擦拭光纖端面后操縱定位儀，使光纖端面接觸目標位置的腦組織表面，注意盡可能將被標記的注射孔置于光纖端面正中。

在顱窗處滴加生理鹽水后，打開光纖光度檢測裝置，運行鈣信號記錄軟件，一邊緩慢地將光纖豎直插入腦組織，一邊觀察并記錄鈣信號。若該過程中有出血現象，停止移動夾持器，反復滴加和吸取生理鹽水直至出血停止，隨后再繼續向下調節夾持器。出血對鈣信號的記錄有一定影響，在開顱手術過程中可適當調整坐標，使光纖植入盡可能避開大血管。隨著光纖逐漸接近目標腦區，可看到信號基線顯著抬升，表明光纖植入方向準確，否則實驗失敗。當光纖端面與注射Ca2+指示劑的位置距離相差小于0.5mm且觀察到明顯的麻醉狀態下的鈣信號后，等待信號基線平穩，隨后關閉裝置光源。在顱窗位置滴加醫用組織膠，并用牙科水泥將金屬套管固定在顱骨表面。手術創口邊緣的皮膚也用醫用組織膠進行粘合以避免滲液影響牙科水泥的固定。待牙科水泥完全干透變硬后，將固定金屬套管的夾持器旋鈕松開。為盡量減少環境光對鈣信號記錄的干擾，在牙科水泥上涂抹黑色丙烯顏料。這一操作可使實驗在正常照明環境下進行，對于小鼠癇樣行為的觀察和判斷更為有利。

鈣信號記錄：

將完成手術的小鼠與加熱墊一起放入籠中恢復。術后大約2h左右，將完全清醒的自由活動的小鼠放入行為學觀察裝置，打開光纖光度檢測裝置的光源，運行記錄軟件，記錄動物自由活動時的自發鈣信號（給藥前30min）和KA皮下給藥后2h內的鈣信號。（3）對各組動物均采用皮下注射KA的方式誘發小鼠急性癇性發作，注射劑量為20mg/kg。用高清攝像頭拍攝并記錄小鼠在KA皮下注射前30min和給藥后2h內的行為學表現。

實驗結束后對每組各只小鼠的行為學視頻進行分析，根據改進的Racine分級法對小鼠癇性發作的嚴重程度進行分級：0級——正常行為；Ⅰ級——失神樣的呆滯；Ⅱ級——聳肩，伴隨面部、前肢的自動樣動作；Ⅲ級——直立，伴隨持續的面部或前肢的自動樣動作，以及持續的前肢陣攣；Ⅳ級——反復地直立和跌倒，伴隨雙側前肢陣攣；Ⅴ級——側臥且伴隨強直陣攣性抽搐，或伴隨抽搐的竄跳與胡亂跑動。Ⅲ級及其以上發作被稱為CMS。達到CMS的動物被認為可納入實驗樣本。

行為學裝置與同步打標

數據分析與統計學處理方法：

①鈣信號的分析用基于分析軟件讀取記錄到的鈣信號，記錄到的鈣信號在分析軟件中經濾波后以△F/F表示，△F/F=（F-Fbase）/（Fbase-B），其中F為實際檢測值，Fbase是細胞靜息狀態下胞內染料的熒光強度，B是細胞周圍的背景噪聲。

②鈣信號和行為學視頻的LED燈，固定于行為學裝置外側背景紙板上。該LED燈的正負極分別連接在光纖光度檢測裝置數據采集卡的輸出端和接地端，實驗人員可通過控制記錄軟件輸出一個﹢5V電壓信號點亮LED燈。在每次視頻剛開始拍攝的5min內進行3次LED燈點亮打標操作。LED燈的點亮除了在行為學視頻中表現外，也在記錄軟件的鈣信號通道中以電壓形式同步表現。因此LED燈的點亮作為使鈣信號記錄和行為學視頻時間同步化的紐帶。在鈣信號分析軟件中，分別導入鈣信號記錄數據和行為學視頻數據，軟件能夠以圖像處理的方式獲得行為學視頻中LED點亮的信號從而實現鈣信號數據與行為學視頻的同步鏈接，其中視頻數據30幀/s，鈣信號數據采樣頻率2000Hz。根據分析需要截取并渲染同步的鈣信號和行為學視頻。

結果分析：

KA給藥前，小鼠自由活動時，其HPC-CA3區正常自發的鈣信號，表現為無節律的單個脈沖樣鈣信號或者連續的鈣信號，其中單個的脈沖樣鈣信號呈現出典型的陡升緩降樣特征，與神經細胞去極化導致的快速的胞內Ca2+濃度升高和相對緩慢的Ca2+的代謝的原理一致。單個的脈沖樣鈣信號幅值大約為0.6~1%，連續的鈣信號的幅值可能由于熒光強度的積累而達到1~1.5%左右。

自由活動小鼠HPC-CA3區正常自發的鈣信號示例

（a）較連續的鈣信號；（b）單個脈沖樣鈣信號

KA給藥后2h內，小鼠HPC-CA3區的出現了與其自由活動時正常自發鈣信號在形態上有顯著差異的癇樣鈣信號。觀察到的癇樣鈣信號主要有4種表現模式：低頻（頻率≤0.5Hz）脈沖樣鈣信號（slow-spike），高頻（頻率≥1Hz）脈沖樣鈣信號（fast-spike），鈣積聚信號（build-up）和鈣波（wave）。不同模式的癇樣鈣信號單獨或以組合的形式共同出現。下圖從上到下的4條癇樣特征鈣信號曲線是按時間發展的先后順序依次出現的。在對小鼠進行皮下注射KA后的5min左右，HPC-CA3區不再出現自發樣的鈣信號，表現為平穩的基線。給藥后10min時，開始出現低頻脈沖樣鈣信號，單個脈沖樣信號的幅值大約為1~5%，頻率逐漸加快。在16min左右，開始出現下圖中所示的鈣積聚信號，信號幅值顯著上升，接著高頻脈沖樣信號伴隨出現，緊接著出現了巨大的鈣波。鈣積聚信號持續約30s，積聚最高處的信號幅值在4%左右。鈣波持續約70s，峰值為7%左右。KA給藥后25min左右，出現了一次幅值約3%的鈣波，持續40s左右，且伴隨著高頻脈沖樣鈣信號。在KA給藥后大約30min時，第二次出現了鈣積聚伴隨高頻脈沖樣信號且連續出現大型鈣波的現象。此次鈣積聚信號和鈣波的峰值、持續時間均較第一次出現時有所減小，鈣積聚峰值3%左右，鈣波峰值約6%，鈣波持續時間約1min。

自由活動小鼠HPC-CA3區KA誘發的癇樣鈣信號示例

（a）~（d）分別是KA給藥后按時間順序依次出現的癇樣鈣信號，以相同的比例尺標示。（a）KA給藥后10min時的低頻脈沖樣鈣信號；（b）KA給藥后16min時的鈣積聚信號與鈣波，鈣積聚信號伴隨有高頻脈沖樣鈣信號；（c）KA給藥后25min時的鈣波，伴隨有高頻脈沖樣鈣信號；（b）KA給藥后30min時的鈣積聚信號與鈣波，鈣積聚信號伴隨有高頻脈沖樣鈣信號。

小鼠急性癇性發作行為與HPC-CA3區癇樣鈣信號的關系小鼠被皮下注射KA后，5min左右即由自由活動狀態發展為Ⅰ級癇性發作，表現為失神樣的呆滯狀態，此后不再出現自發的鈣信號。KA給藥后10min開始出現低頻脈沖樣鈣信號時，小鼠保持呆滯狀態。隨后，脈沖樣信號頻率明顯加快，但小鼠仍保持呆滯狀態。這種呆滯狀態一直持續到鈣積聚信號上升至頂峰時，當鈣積聚信號回落至平臺期，小鼠開始表現出Ⅱ級癇性發作行為，表現為點頭和面部陣攣。當緊接著鈣積聚信號的大型鈣波曲線開始上升時，小鼠癇性發作行為發展為Ⅲ級發作，出現前肢陣攣的動作，即達到CMS；當鈣波下降至中段時，小鼠恢復呆滯狀態直至鈣波不再下降，小鼠在此時仍保持呆滯狀態（如下）。

HPC-CA3區第1次鈣積聚與鈣波出現時小鼠的癇性發作行為示例

（a）低頻脈沖樣鈣信號出現時小鼠表現為Ⅰ級發作的呆滯狀態；（b）鈣積聚信號上升至頂峰時小鼠仍保持呆滯狀態；（c）鈣積聚信號平臺期小鼠開始發展為Ⅱ級發作的點頭和面部陣攣；（d）鈣波波峰附近小鼠Ⅲ級發作：前肢陣攣直到鈣波下降至中段（e）；（f）鈣波谷底恢復呆滯狀態的小鼠。

參考文獻：

• Grienberger C and Konnerth A. Imaging calcium in neurons [J]. Neuron,2012,8,73(5): 862-85.

• Tse K, Puttachary S, Beamer E, et al. Advantages of repeated low dose against single high dose of kainate in C57BL/6J mouse model of status epilepticus: behavioral and electroencephalographic studies [J]. PLoS One,2014,6,9(5): e96622.

• 劉楠楠. 基于光纖光度檢測法的癲癇樣小鼠海馬、內嗅皮層鈣信號的研究[D].天津醫科大學,2018.

• McKhann GM, Wenzel HJ, Robbins CA, et al. Mouse strain differences in kainic acid sensitivity, seizure behavior, mortality, and hippocampal pathology [J]. Neuroscience,2003,122(2): 551-61.

• 史娟，李繼碩．細胞內鈣成像和鈣測定的基本原理及應用［Ｊ］．神經解剖學雜志，2006，22(4)：455-462.