流感病毒是全球性的公共衛(wèi)生問(wèn)題，它不僅會(huì)導(dǎo)致季節(jié)性流感，還會(huì)引發(fā)偶發(fā)的大流行，給人類(lèi)健康帶來(lái)嚴(yán)重威脅。歷史上多次流感大流行造成了數(shù)以百萬(wàn)計(jì)的死亡，例如 1918年大流行就導(dǎo)致了約5000萬(wàn)人死亡。此外，季節(jié)性流感每年也會(huì)導(dǎo)致29萬(wàn)至65萬(wàn)人死亡。由于流感病毒的包膜蛋白具有高突變率，現(xiàn)有的疫苗無(wú)法有效預(yù)防新出現(xiàn)的病毒株。目前主流的抗流感藥物主要針對(duì)病毒的包膜蛋白，但抗藥性問(wèn)題日益嚴(yán)重。近年來(lái)，雖然有新的抗病毒藥物如瑪巴洛沙韋獲批，但耐藥病毒株也迅速出現(xiàn)。因此，開(kāi)發(fā)新的廣譜流感疫苗和抗病毒藥物迫在眉睫。

流感病毒屬于正黏病毒科，是一種分節(jié)段的負(fù)義單鏈 RNA病毒。其基因組包含7或8個(gè)RNA片段，每個(gè)片段編碼至少一種病毒蛋白。病毒的核糖核蛋白復(fù)合物（RNP）由病毒基因組RNA片段、多個(gè)核蛋白（NP）亞基和聚合酶復(fù)合物組成，負(fù)責(zé)在宿主細(xì)胞中執(zhí)行病毒基因組的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制。與包膜蛋白相比，NP和聚合酶復(fù)合物在進(jìn)化上更為保守，因此被認(rèn)為是開(kāi)發(fā)抗病毒藥物的理想靶點(diǎn)。然而，由于RNP的結(jié)構(gòu)復(fù)雜且具有高度柔性，其高分辨率結(jié)構(gòu)分析一直是一個(gè)挑戰(zhàn)。

美國(guó)賓夕法尼亞州立大學(xué) Yi-Wei Chang 通過(guò)結(jié)合冷凍電鏡單顆粒分析（ SPA）和冷凍電子斷層掃描（cryo-ET）技術(shù)，揭示了流感RNP的高分辨率結(jié)構(gòu)，并提出了流感病毒復(fù)制過(guò)程中RNP如何維持其雙螺旋結(jié)構(gòu)的同時(shí)進(jìn)行RNA合成的機(jī)制。此外，研究還通過(guò)虛擬篩選發(fā)現(xiàn)了針對(duì)RNP的潛在抗流感藥物先導(dǎo)化合物。 相關(guān)內(nèi)容以“ Molecular basis of influenza ribonucleoprotein complex assembly and processive RNA synthesis ”為題發(fā)表在《

S

cience

【核心結(jié)果】

RNP結(jié)構(gòu)解析： 通過(guò)SPA技術(shù)，研究者們發(fā)現(xiàn)流感D病毒的RNP呈現(xiàn)出右手、反平行的雙螺旋結(jié)構(gòu)，NP亞基通過(guò)尾環(huán)連接，RNA被封裝在雙螺旋的小溝中。通過(guò)STA技術(shù)，研究者們進(jìn)一步確認(rèn)了這一結(jié)構(gòu)，并觀察到RNP在不同功能狀態(tài)下呈現(xiàn)出多種不同的構(gòu)象，表明雙螺旋內(nèi)部存在動(dòng)態(tài)的鏈間運(yùn)動(dòng)。

聚合酶復(fù)合物的可視化： 研究者們?cè)?RNP的預(yù)啟動(dòng)和延伸狀態(tài)下可視化了聚合酶復(fù)合物，發(fā)現(xiàn)聚合酶始終與RNP的外表面相關(guān)聯(lián)，支持了一種螺旋鏈滑動(dòng)模型，即聚合酶沿著RNA模板進(jìn)行RNA合成，同時(shí)保持RNP的整體雙螺旋結(jié)構(gòu)。

抗流感藥物先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)： 通過(guò)虛擬篩選，研究者們針對(duì) NP的尾環(huán)結(jié)合界面識(shí)別出了一些先導(dǎo)化合物，這些化合物在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中有效抑制了流感病毒的復(fù)制。

【主要內(nèi)容】

圖1流感D病毒NS段RNP的體外重組與純化

圖中 展示了流感 D病毒NS段RNP的重組過(guò)程。通過(guò)共轉(zhuǎn)染NP、聚合酶亞基和NS RNA片段到HEK293T細(xì)胞中，利用串聯(lián)親和純化技術(shù)分離出完整的RNP復(fù)合物。重組的RNP呈現(xiàn)桿狀結(jié)構(gòu)，長(zhǎng)度主要集中在35-45 nm，比長(zhǎng)RNP更剛性。實(shí)驗(yàn)還證實(shí)了重組RNP的活性，檢測(cè)到病毒RNA（vRNA）和互補(bǔ)RNA（cRNA），其中vRNA含量遠(yuǎn)高于cRNA，與病毒感染細(xì)胞中的情況類(lèi)似。此外，觀察到聚合酶在RNP復(fù)合物中的不同位置，表明其可能處于啟動(dòng)、終止或延伸狀態(tài)。

圖2流感D病毒NS段RNP的雙螺旋結(jié)構(gòu)

通過(guò)冷凍電鏡單顆粒分析（ SPA）解析了流感D病毒NS段RNP的高分辨率結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示RNP為右手、反平行的雙螺旋結(jié)構(gòu)，NP亞基通過(guò)尾環(huán)連接，病毒RNA被封裝在雙螺旋的小溝中。每個(gè)NP亞基可容納約20個(gè)核苷酸，RNA結(jié)合槽高度帶正電荷，有利于RNA的結(jié)合。此外，還觀察到NP亞基之間的開(kāi)放口袋，可能允許RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)伸出RNP。

圖2流感D病毒NS段RNP的雙螺旋結(jié)構(gòu)

通過(guò)冷凍電鏡單顆粒分析（ SPA）解析了流感D病毒NS段RNP的高分辨率結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示RNP為右手、反平行的雙螺旋結(jié)構(gòu)，NP亞基通過(guò)尾環(huán)連接，病毒RNA被封裝在雙螺旋的小溝中。每個(gè)NP亞基可容納約20個(gè)核苷酸，RNA結(jié)合槽高度帶正電荷，有利于RNA的結(jié)合。此外，還觀察到NP亞基之間的開(kāi)放口袋，可能允許RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)伸出RNP。

圖3流感A病毒天然RNP的構(gòu)象景觀

利用冷凍電子斷層掃描（ cryo-ET）和子斷層平均法（STA）分析了流感A病毒天然RNP的結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示RNP為右手雙螺旋結(jié)構(gòu)，與重組RNP類(lèi)似，但天然RNP更伸展，展現(xiàn)出更高的動(dòng)態(tài)性。NP亞基在雙螺旋中可以沿軸向和垂直于軸向自由旋轉(zhuǎn)，導(dǎo)致相鄰NP亞基之間的距離和小溝的寬度沿螺旋路徑變化，這種動(dòng)態(tài)性可能有助于RNP在RNA合成過(guò)程中的鏈間滑動(dòng)。

圖4流感D病毒NS段RNP聚合酶端的結(jié)構(gòu)

通過(guò)冷凍電子斷層掃描（ cryo-ET）和子斷層平均法（STA）解析了流感D病毒NS段RNP聚合酶端的結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示聚合酶位于RNP末端，與末端NP亞基之間存在約12-18 ?的間隙，表明聚合酶與NP之間的相互作用可能是靈活的或瞬時(shí)的。聚合酶的結(jié)合需要至少15-20個(gè)核苷酸的RNA片段來(lái)連接末端NP亞基和聚合酶中的RNA末端。

圖5流感D病毒NS段RNP在RNA延伸過(guò)程中的結(jié)構(gòu)

通過(guò)冷凍電子斷層掃描（ cryo-ET）和子斷層平均法（STA）解析了流感D病毒NS段RNP在RNA延伸過(guò)程中的結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示聚合酶位于RNP中間，與兩個(gè)末端NP亞基相互作用。聚合酶從雙螺旋的一側(cè)讀取RNA模板，而另一側(cè)的NP亞基則通過(guò)局部構(gòu)象變化（“服務(wù)構(gòu)象”）釋放RNA，使其可供聚合酶使用。這種機(jī)制允許聚合酶在RNP的一條鏈上保持靜止，而在另一條鏈上移動(dòng)，從而實(shí)現(xiàn)雙螺旋鏈之間的滑動(dòng)。

圖6針對(duì)NP尾環(huán)結(jié)合界面的抑制劑設(shè)計(jì)

基于 NP尾環(huán)結(jié)合界面的結(jié)構(gòu)特征，設(shè)計(jì)并篩選了針對(duì)該界面的抑制劑。通過(guò)虛擬篩選和表面等離子共振（SPR）實(shí)驗(yàn)，識(shí)別出三種候選化合物（化合物1、5和23），它們對(duì)單體NP具有良好的結(jié)合親和力，而對(duì)三聚體NP的結(jié)合較弱。這些化合物在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中顯示出對(duì)流感A病毒復(fù)制的抑制作用，其中化合物1和5的抑制效果較好，且在低濃度下無(wú)明顯細(xì)胞毒性。

【全文總結(jié)】

本文通過(guò)結(jié)合冷凍電鏡單顆粒分析（ SPA）和冷凍電子斷層掃描（cryo-ET）技術(shù)，揭示了流感病毒核糖核蛋白復(fù)合物（RNP）的高分辨率結(jié)構(gòu)及其在RNA合成過(guò)程中的動(dòng)態(tài)機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，流感RNP呈現(xiàn)為右手、反平行的雙螺旋結(jié)構(gòu)，病毒RNA被封裝在雙螺旋的小溝中，相鄰的核蛋白（NP）亞基通過(guò)尾環(huán)相互連接。聚合酶復(fù)合物在RNP的外表面與雙螺旋結(jié)構(gòu)相互作用，通過(guò)鏈間滑動(dòng)模型沿著RNA模板進(jìn)行RNA合成，同時(shí)保持RNP的整體雙螺旋架構(gòu)。此外，研究還通過(guò)虛擬篩選發(fā)現(xiàn)了針對(duì)NP尾環(huán)結(jié)合界面的潛在抗流感藥物先導(dǎo)化合物，這些化合 物在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中有效抑制了流感病毒的復(fù)制。這些發(fā)現(xiàn)不僅增進(jìn)了我們對(duì)流感病毒復(fù)制機(jī)制的理解，還為開(kāi)發(fā)下一代廣譜抗流感治療藥物提供了重要的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)和潛在的藥物靶點(diǎn)。

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