撰文 | 咸姐

近年來，隨著液體活檢技術的快速發展，基于血液的非侵入性檢測方法已成為癌癥診斷和治療監測的重要手段。液體活檢通過分析血液中的生物標志物，如循環腫瘤DNA（ctDNA）、循環腫瘤細胞（CTC）和細胞游離RNA（cfRNA），能夠實現癌癥的早期檢測、組織來源（Tissue-of-origin，TOO）分類、基因分型以及疾病監測等多重應用。其中，ctDNA分析因其在晚期惡性腫瘤患者中的非侵入性腫瘤基因分型中的廣泛應用而備受關注。通過檢測ctDNA中的可操作突變，臨床醫生能夠為患者提供精準的靶向治療方案，顯著改善患者的預后。然而，盡管ctDNA分析取得了顯著進展，但其在早期腫瘤檢測中的靈敏度仍有待提高。相比之下，cfRNA分析作為一種新興的液體活檢方法，具有獨特的潛力。cfRNA是指血液中游離存在的RNA分子，它們可以來源于腫瘤細胞、正常細胞以及其他組織。cfRNA分析能夠提供更廣泛的分子特征信息，包括基因表達譜、剪接變異和非編碼RNA等，從而為癌癥的早期檢測和精準診斷提供更全面的視角【1,2】。然而，cfRNA分析也面臨著諸多挑戰。血液中絕大多數的循環轉錄本是由造血細胞釋放的，這使得腫瘤來源的稀有循環腫瘤RNA（ctRNA）分子的檢測變得極為困難。此外，cfRNA在血液中高度降解，其濃度遠低于ctDNA，這進一步增加了檢測的難度【3,4】。因此，開發一種能夠高效捕獲和分析cfRNA的方法，對于提高非侵入性癌癥診斷的靈敏度和準確性具有重要意義。

近日，來自美國斯坦福大學的Maximilian Diehn團隊在Nature在線發表題為An ultrasensitive method for detection of cell-free RNA的文章，開發了一種專門針對cfRNA分析的優化的檢測方法——RARE-seq（隨機引物和親和捕獲cfRNA片段進行富集分析的測序方法），其可以在保持腫瘤初始癌癥檢測的高度特異性的同時，提高對ctRNA的檢測極限，并探索了RARE-seq在多種臨床應用中的潛在用途，包括無創ctRNA基因分型、治療耐藥性監測、TOO分析以及非惡性疾病的分子表征。

本文研究人員首先探討了影響cfRNA提取和分析的分析前因素，發現cfRNA高度降解且濃度低，優化了血液采集和RNA提取方法，確認溶血不影響cfRNA產量，且cfRNA在冷凍儲存第一個月后濃度穩定。通過去除污染DNA、優化cDNA合成和末端修復等步驟，提高了文庫制備效率。所有這些優化方法統稱為RARE-seq（圖1）。此外，通過將RARE-seq應用于10名健康成人的cfRNA和匹配的白細胞RNA，來表征細胞RNA和cfRNA之間的表達差異，結合基因組富集分析（GSEA）和來自單細胞RNA-seq圖譜的細胞類型特異性基因組，發現cfRNA中顯著富集了非造血細胞類型的基因，包括內皮細胞、肝細胞和成纖維細胞等，而白細胞RNA則主要富集了造血細胞類型的基因。值得注意的是，cfRNA中血小板基因的表達水平顯著高于其他造血細胞類型。通過實驗，研究人員證明，血小板是cfRNA表達變異的最大來源，血小板污染是cfRNA分析中的一個關鍵變量，如果不加以控制，可能會顯著影響cfRNA分析的結果。然而，現實中想要完全去除cfRNA樣品中血小板來源的RNA是幾乎不可能的，因此研究人員開發了一種計算方法來消除血小板污染對cfRNA基因表達的影響，成功地提高了cfRNA分析的特異性。

圖1 RARE-seq方法示意圖

cfRNA中大部分基因表達水平較低，尤其是那些在非造血組織中高表達的基因。這些基因在健康cfRNA中的表達量遠低于造血細胞來源的基因（如globin）和高表達的管家基因（如β-actin）。為了提高對非造血組織來源或疾病相關基因的檢測靈敏度，研究人員開發了一種基于RARE-seq的靶向捕獲策略。他們分析了健康個體的cfRNA樣本和全血樣本的全編碼轉錄組數據，篩選出在健康cfRNA和全血中低表達或缺失的“稀有豐度基因”（RAG）。這些RAG在非造血組織特異性和癌癥特異性基因中顯著富集。實驗結果表明，RAG靶向捕獲策略在檢測低表達基因方面具有更高的獨特測序深度和更多基因檢測數量，顯著提高了ctRNA檢測的靈敏度。RARE-seq的檢測極限（LOD95）達到了0.05%，比全編碼轉錄組RARE-seq提高了50倍以上，證明了靶向RAG策略的有效性。

在開發和優化了RARE-seq之后，研究人員將其用于多個臨床應用中的cfRNA分析中。首先，研究人員利用RARE-seq技術分析了139例非小細胞肺癌（NSCLC）患者（以肺腺癌LUAD為主）和50例無癌對照個體的血漿樣本中的cfRNA。研究結果鑒定出96個在NSCLC患者中過表達的基因，證明LUAD患者的cfRNA富含在LUAD腫瘤中高表達的轉錄本。而且LUAD特異性基因簽名（LUAD Sig）在73%的NSCLC患者中被檢測到，且檢測靈敏度隨腫瘤分期增加而提高（I期30%，II期62%，III期67%，IV期83%），特異性達到95%。此外，與腫瘤原始ctDNA分析相比，RARE-seq在檢測腫瘤相關cfRNA方面更為敏感，表明其在NSCLC的早期檢測和疾病監測中具有顯著優勢。

與此同時，研究人員還探索了利用RARE-seq對癌癥衍生的體細胞突變進行基因分型的能力。研究人員開發了一種定制的ctRNA基因分型方法來檢測臨床可操作的變異，包括復發性NSCLC癌基因中的單核苷酸變異（SNV）、插入或缺失（indel）、剪接變異和基因融合。實驗結果表明RARE-seq不僅能夠檢測ctRNA中的體細胞突變，還能通過基因表達和突變信息的結合，更全面地識別腫瘤相關特征。除此之外，研究人員還利用RARE-seq技術分析了10名接受EGFR-TKI治療后產生耐藥性的NSCLC患者的血漿樣本。RARE-seq成功檢測到小細胞肺癌（SCLC）轉化、MET基因擴增和EGFR C797S突變等多種耐藥機制，且在耐藥前的血樣中未被檢測到，證實了RARE-seq方法的特異性。此外，對于發生SCLC轉化的患者，治療后血漿中SCLC特征的cfRNA富集評分降低，表明RARE-seq能夠監測治療反應。同樣，對于MET基因擴增的患者，在加入MET抑制劑后，血漿中MET擴增特征的cfRNA富集評分也有所下降。這些結果表明，RARE-seq不僅可以檢測基于突變的耐藥機制，還能識別非遺傳性耐藥機制，如組織學轉化，為臨床提供了一種非侵入性的耐藥監測手段。

進一步地，研究人員使用RARE-seq技術分析了多種癌癥患者的血漿樣本，通過癌癥特異性基因簽名和cfRNA富集評分框架來確定ctRNA的TOO。結果顯示，該方法在檢測胰腺腺癌、前列腺腺癌和肝細胞癌時均具有較高的靈敏度。此外，通過組織來源基因簽名（cancer-TOO signatures），RARE-seq在預測癌癥類型時也具有較高的正確識別率。這表明RARE-seq能夠有效識別ctRNA的TOO，為非侵入性診斷和區分癌癥類型提供了有力工具。值得一提的是，研究人員還通過RARE-seq技術分析了患有慢性阻塞性肺病（COPD）、COVID-19感染和ICU中肺損傷患者的cfRNA。結果顯示，49%的患者可檢測到肺源性cfRNA，而無肺部疾病的個體中僅14%可檢測到，且吸煙者和使用呼吸機的患者檢測率更高。對新冠疫苗接種者進行分析發現，疫苗RNA在接種后可立即檢測到并持續6周，宿主基因表達變化與免疫激活相關。這些結果表明RARE-seq技術可用于評估非惡性疾病中的肺損傷，并且在同時測量基于RNA的療法的藥代動力學和藥效學方面具有巨大潛力。

綜上所述，本研究開發了一種用于cfRNA分析的多功能方法，該方法在多種臨床環境中具有潛在的實用性。本研究的結果還提出了一些重要的生物學和技術見解，并且可能會廣泛適用于基于cfRNA的液體活檢應用。本研究的方法將能夠實現新的非侵入性診斷應用，有望推動精準醫療的發展并改善患者的護理。

原文鏈接：https://doi.org/10.1038/s41586-025-08834-1

制版人： 十一

參考文獻

1. Larson, M. H. et al. A comprehensive characterization of the cell-free transcriptome reveals tissue- and subtype-specific biomarkers for cancer detection.Nat. Commun. 12, 2357 (2021).

2. Chen, S. et al. Cancer type classification using plasma cell-free RNAs derived from human and microbes.eLife11, e75181 (2022).

3. Ibarra, A. et al. Non-invasive characterization of human bone marrow stimulation and reconstitution by cell-free messenger RNA sequencing.Nat. Commun. 11, 400 (2020).

4. Akat, K. M. et al. Detection of circulating extracellular mRNAs by modified small-RNA sequencing analysis.JCI Insight5, e127317 (2019).

學術合作組織

（*排名不分先后）

戰略合作伙伴

（*排名不分先后）

（*排名不分先后）

轉載須知

【原創文章】BioArt原創文章，歡迎個人轉發分享，未經允許禁止轉載，所刊登的所有作品的著作權均為BioArt所擁有。BioArt保留所有法定權利，違者必究。

BioArt

Med

Plants

人才招聘

會議資訊

近期直播推薦