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睡眠剝奪小鼠模型的建立

根據睡眠缺失的情況，一般將睡眠剝奪分為完全睡眠剝奪（TSD）和選擇性睡眠剝奪（SSD）。既往研究中TSD一般指至少24h完全睡眠缺失，SSD指睡眠時相的剝奪如REM-SD或NREM-SD。與二者相比，日常生活中人類睡眠剝奪大多介于二者之間，尤其是住院患者、慢性疼痛及失眠人群中經常出現睡眠少于6hTSD。因此，為了最大限度的模擬臨床手術患者睡眠剝奪模式，可選擇TSD剝奪模式。對于睡眠剝奪方法，以往多采用改良的多平臺法制作大鼠睡眠剝奪，此方法主要用于REM睡眠剝奪，對NREM干擾有限，而且由于掉落水中會對動物產生應激影響實驗結果。

參考最新TSD相關研究，在飼養小鼠的圓形鼠籠底部安裝可旋轉的機械裝置，其中有一根緩慢旋轉的棒產生輕柔、持續的機械刺激避免小鼠睡覺。此裝置去除了以往裝置中小鼠持續的強迫運動，減少了應激干擾。睡眠剝奪前將小鼠放入儀器中熟悉環境24h，睡眠剝奪期間小鼠自由飲食，剝奪后在儀器中自由睡眠飲食，減少更換飼養環境的干擾。根據文獻資料設定剝奪時間為3天，每天9h（AM7:00-PM4:00）。第三天結束后進行行為學測試及相關實驗。為了保證此種睡眠剝奪方法的效果，首先通過給小鼠頭部置入腦電圖（EEG）/肌電圖（EMG）監測睡眠情況，確定睡眠剝奪模型構建成功。

- Fig1 睡眠剝奪流程示意圖 -

小鼠腦電圖（EEG）/肌電圖（EMG）置入手術

為記錄腦電圖（EEG）/肌電圖（EMG），首先用電路板及銀絲焊接自制電極，雙通道腦電與雙通道肌電。使用3vol%異氟醚誘導小鼠麻醉，將小鼠固定在腦立體定位儀上。在手術過程中維持吸入濃度在1.2-1.5vol%，剃除小鼠頭頸部毛發，碘伏消毒手術部位。用眼科剪從頭部開始做一個1.0厘米長的橢圓形切口（前至雙眼連線，后至頸部上緣），鈍性分離皮下組織，用棉簽浸潤無菌生理鹽水剝離顱骨上粘膜及骨膜充分暴露顱骨。用顱骨鉆打孔，注意要鉆通顱骨，避免損傷硬腦膜，以免影響EEG記錄質量。使用3顆不銹鋼螺釘（1×3mm）作為EEG電極，并植入顱骨表面（坐標）：正極（AP:-1.0mm，ML:-1.5mm），負極（AP:-2.0mm,ML:1.5mm）和參考電極（AP:-4.0mm,ML:-1.5mm），植入深度約0.5mm。將不銹鋼螺絲釘擰轉、固定在上述鉆好的顱骨孔中，深度以螺絲釘正好越過顱骨為易（螺絲紋2-3圈），出血時可用棉簽壓迫或生理鹽水沖洗。將兩條銀絲電極埋植于頸部兩側的斜方肌內。用牙科水泥將螺絲釘固定于顱骨表面（注意不要將導電的銀絲覆蓋）。待牙科水泥固定后，用電烙鐵將對應的銀絲焊接至自制的電路板，再次用牙科水泥將電路板固定于頭部。待完全固定后停止麻醉，小鼠蘇醒后放置鼠籠單獨飼養，術后恢復一周用于實驗。

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腦電（EEG）/肌電（EMG）圖記錄及分析

將置入腦電（EEG）/肌電（EMG）的小鼠放入睡眠剝奪儀中，經過萬向輪傳至前置放大器，經放大后傳至Power Lab生理記錄儀系統采集腦電信號，設置采樣頻率為128Hz。信號濾波設置為：EEG，0.5—50Hz；EMG，30—300Hz。使用Sirenia Sleep Pro軟件對腦電信號進行分析，所有腦電波均以10s為一個epoch。NREM腦電圖為低頻（0.5-4hz范圍），高振幅（+/-150-250mv）delta波，低振幅EMG波。REM腦電波以θ波為主（6-9hz范圍）、低振幅（+/-50-100mV）和平坦的混合頻率肌電圖。Wake期腦電圖為高頻（8~50Hz）、低振幅（+/-50~100mV）、高振幅肌電圖。軟件分析是半自動化的，首先使用聚類評分設定，根據設定條件軟件自動掃描，根據肌電圖功率、EEG振幅和頻率將一個epoch劃分為REM、NREM或Wake狀態。自動分析結束后對自動掃描的epoch進行檢查，以確保每個epoch都根據定義進行評定，對未進行分析的epoch則手動根據定義評定。

- 多模態信號同步采集（EEG+ECG+EMG+體動）-

小鼠機械痛閾值的測定

所有實驗小鼠均在同一行為學房間進行測試，將實驗小鼠用有機透明玻璃觀察盒子（三面黑色，一面透明，防止小鼠之間互相干擾）隔開，放置在金屬鐵絲網上，保持室內安靜至少半小時以上，直到小鼠不在出現尋覓、排便等行為時開始測定。使用標準的von Frey纖維絲測定機械痛閾，根據預實驗選取測量Von Frey纖維絲分別為0.07、0.16、0.4、0.6、1、1.4和2g。將纖維絲垂直刺激小鼠的右后腳掌心，緩慢用力直到纖維絲微微彎曲（持續1-3s），當小鼠突然回撤爪子或者舔腳掌的行為時記錄為陽性反應。痛閾測定時從纖維絲0.6g開始，每個彎曲力刺激5次，三次或三次以上的陽性反應為陽性結果。使用up-and-down方法記錄小鼠出現陽性結果的纖維絲對應的克數即為小鼠機械刺痛的閾值。為防止因為頻繁刺激影響結果，每次間隔1min左右。刺激時，小鼠出現走動尋覓或者刺激一接觸就出現提足行為時，需要等小鼠安靜下來再進行測量。

小鼠熱刺痛閾值的測定

將實驗小鼠用有機透明玻璃觀察盒子（三面黑色，一面透明，防止小鼠之間互相干擾）隔開，放置在熱痛測定專用玻璃板上，待小鼠能靜止狀態時（不四處走動）開始測定。使用熱痛儀激光垂直照射小鼠的右后腳掌心，當小鼠出現抬腳或者舔腳的反應則記錄為陽性結果，從開始輻射熱刺激到出現陽性反應時的時間為縮爪潛伏期（Withdrawal latency）。根據預實驗調整輻射熱源的強度，使正常小鼠縮爪潛伏期維持在15s左右，并設置切斷時間為30s。每只小鼠進行三次實驗，每次間隔5min，三次實驗所記錄時間的平均值即為小鼠的熱刺痛閾值。

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EEG/EMG記錄結果(參數)

首先對旋轉棒干擾睡眠的效果進行評價。根據睡眠剝奪實施方案，持續監測記錄小鼠的EEG/EMG，分析判斷Wake、NREM和REM各階段的時間。與對照組相比睡眠剝奪組Wake時間明顯延長，NREM和REM期幾乎被消除。其中Wake期占總時間的96.16%，NREM期占總時間的3.78%，REM占總時間的0.06%。而對照組Wake期占總時間的33.04%，NREM期占總時間的55.12%，REM期占總時間的11.84%。此種睡眠剝奪方法可使小鼠在剝奪期處于幾乎完全清醒狀態，EEG顯示隨著睡眠剝奪時間的延長，睡眠壓力升高，小鼠進入NREM的嘗試更多。

- Fig2 CBD增加睡眠剝奪小鼠睡眠恢復期的覺醒能力 -

文獻引用

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