【寫在前面】：本期推薦的是由福建醫科大學基礎醫學院研究團隊近期發表于Phytomedicine(IF=6.7）的一篇文章，揭示蘇木酮A通過靶向小鼠中的Mup3減少肝細胞脂毒性，有效緩解與代謝功能障礙相關的脂肪性肝炎。

【期刊簡介】

【題目及作者信息】

Sappanone A alleviates metabolic dysfunction-associated steatohepatitis by decreasing hepatocyte lipotoxicity via targeting Mup3 in mice

背景與目的：代謝功能障礙相關脂肪性肝炎（MASH）是一種炎癥性脂毒性紊亂，其特征是肝臟脂肪變性、肝細胞損傷、炎癥以及不同程度的纖維化。蘇木酮A（SA）是一種黃酮類化合物，具有抗炎和保肝活性。然而，SA對MASH的影響尚不明確。我們評估了SA對MASH小鼠肝細胞脂毒性、炎癥和纖維化狀況的影響，以及其潛在的作用機制。

方法：采用傳統的小鼠MASH模型，即喂食MCD飲食的小鼠，來評估SA在體內對MASH的作用。通過藥物靶點預測和肝臟轉錄組學來闡明SA的潛在作用。AML12細胞被用于進一步探索SA在體外的效果和機制。

結果：計算機預測表明SA能夠調節炎癥、胰島素抵抗、脂質代謝和膠原蛋白分解過程。SA劑量依賴性地降低了飲食誘導的MASH小鼠血清中ALT和AST的升高水平，且高劑量SA治療的效果與水飛薊素類似。此外，SA治療顯著減少了代謝應激下脂質沉積、炎癥和纖維化的程度，且呈劑量依賴性。另外，SA減輕了棕櫚酸誘導的肝細胞脂毒性。肝臟轉錄組學進一步證實了上述發現。值得注意的是，mRNA測序分析和分子生物學實驗表明，SA顯著上調了肝臟中主要尿蛋白3（Mup3）的表達，從而促進脂質運輸并抑制脂毒性。此外，在肝細胞中敲低Mup3顯著消除了SA提供的肝保護作用。

結論：SA通過減少肝細胞中的脂質積累和脂毒性來緩解MASH，至少部分是通過靶向Mup3實現的，進而阻斷MASH進程。因此，SA有望成為MASH背景下的一種有前景的保肝劑。

（圖文摘要）

【前言】

代謝功能障礙相關脂肪性肝炎（MASH，原稱NASH），是代謝功能障礙相關脂肪性肝病（MASLD，原稱NAFLD）的晚期形式，其特征是肝臟脂肪變性、炎癥和進行性纖維化。它可能會發展為肝硬化和肝癌，盡管在臨床上常常是無癥狀的。據估計，普通人群中MASLD的全球患病率約為30%，并且仍在以驚人的速度上升。然而，迄今為止，尚無批準的針對MASH及其并發癥的有效治療方法。因此，迫切需要開發針對這種高發疾病的有效治療策略。

盡管目前MASH的分子發病機制尚不可預測，但在MASH的發展過程中，涉及的一個關鍵事件是由肝細胞中大量脂質沉積引起的脂毒性。當肝細胞無法通過將多余的游離脂肪酸（FFAs）包裝成甘油三酯（TG）來管理這些額外的脂肪酸時，就會發生脂毒性，通常會導致脂肪細胞凋亡。在這種情況下，脂毒性期間受損的肝細胞會分泌各種因子，包括細胞因子和趨化因子，直接刺激肝臟中的駐留或循環巨噬細胞、竇狀內皮細胞和肝星狀細胞（HSCs），以及招募其他免疫細胞類型。在不同肝內細胞類型相互作用的背景下，持續的肝臟炎癥反應和過多的纖維積累會導致肝纖維化甚至肝硬化。相應地，肝內細胞通過釋放分子進行的相互交流將脂毒性與炎癥和纖維化聯系起來，從而促進MASH的發展。

載脂蛋白在脂質運輸中起著關鍵作用。它們的主要功能是作為脂蛋白的結構成分，促進脂質通過血液和淋巴的運輸。當載脂蛋白功能受限時，肝細胞內的脂質穩態會發生變化，導致肝臟損傷。因此，調節肝細胞中的脂質運輸可以調節脂毒性的發生，并進一步影響MASH的進展。

主要尿蛋白（Mups）是一種載脂蛋白，它們具有保守的β-結構，使其能夠作為各種疏水配體的轉運蛋白，包括類固醇激素、信息素和脂質。Mups主要在肝臟中表達并釋放到尿液中。排泄到尿液中的Mups作為信息素參與嗅覺交流，而體內循環的Mups被認為在脂質運輸和外源性解毒中起著重要作用。迄今為止，許多研究已經證實Mups作為載脂蛋白參與肝臟脂質穩態。在遺傳性和飲食誘導的肥胖和糖尿病以及能量攝入減少的情況下，Mup1或Mup5的表達和血漿含量顯著降低。此外，Mup1可以通過其疏水結構與棕櫚酸（PA）結合，并改善線粒體功能障礙。此外，在糖尿病模型中，補充重組Mup1顯著降低了高血糖。觀察到在低密度脂蛋白受體缺陷小鼠中Mup19的表達下調，而在給予低脂高碳水化合物飲食的小鼠中表達下調，而在喂食顆粒飼料的小鼠中表達增加，表明Mup19可能有助于脂質代謝。Mup3與其他Mup家族成員具有相似的功能，并有助于脂質代謝。因此，Mups可能作為減輕MASLD或MASH的有希望的治療靶點。

生活方式的改變，如飲食干預和運動訓練，仍然是MASLD患者的核心建議。然而，對生活方式改變的依從性差是管理MASLD的一個重大挑戰，使得藥物治療對于治療MASLD及其進展階段MASH變得不可或缺。然而，目前尚無專門針對MASLD和MASH患者的批準藥物。包括胰高血糖素樣肽-1受體激動劑、核受體激活劑（例如，elafibranor和GFT505）和胰島素增敏劑（例如，glitazones，metformin）在內的幾種藥物仍在MASH的藥物研發管線中。因此，針對進展性MASH的治療藥物開發存在未滿足的醫療需求。傳統中藥（TCM）因其為治療MASH提供更多的選擇而受到越來越多的關注。水飛薊素（Sily）通過多種途徑減輕MASH，包括調節脂質代謝、抗炎和抗氧化應激。值得注意的是，水飛薊素已注冊用于針對MASH治療的4期臨床試驗。因此，水飛薊素在本研究中被用作陽性對照藥物。

蘇木酮A（SA），是一種從Caesalpinia sappan Linn.中提取的生物活性同型異黃烷酮，具有多種藥理作用，如抗炎和抗氧化活性。先前的研究表明，SA通過抑制糖尿病小鼠中的NF-κB信號通路減輕腎臟炎癥和纖維化。此外，SA減輕了腦缺血再灌注損傷小鼠模型中內質網（ER）應激引起的炎癥和氧化應激損傷。我們先前的研究進一步表明，SA通過調節小鼠中M2型巨噬細胞極化減輕了四氯化碳誘導的肝纖維化。然而，SA預防MASH的潛在機制尚不清楚。鑒于MASH以肝臟脂肪變性、炎癥和纖維化為特征，我們假設SA可能在管理MASH方面發揮積極作用。因此，本研究利用體內MASH小鼠模型和體外脂毒性模型來探究SA的藥理作用。此外，還對小鼠肝臟組織進行了mRNA測序分析，以闡明SA的相關作用靶點或途徑。我們的研究可能會增強對SA對抗MASH保護機制的理解。

【結果】

1、蘇木酮A可能阻礙MASH進展的潛在靶蛋白預測

通過PharmMapper服務器預測了蘇木酮A的潛在靶蛋白。然后，在DAVID數據庫中對GO和KEGG術語進行了富集。GO術語主要包括膠原蛋白分解過程、對脂多糖的響應、胰島素信號通路、膽固醇儲存的負向調控以及脂肪酸結合（圖1E）。KEGG富集術語包括代謝途徑、脂質和動脈粥樣硬化、胰島素抵抗、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路以及IL - 17信號通路（圖1F）。這些富集術語與脂質代謝、炎癥和纖維生成密切相關，表明蘇木酮A可能對MASH的進展具有延緩作用。

2、蘇木酮A對MCD誘導的小鼠肝臟損傷的治療效果

如前所述，小鼠分組并給藥如圖2A所示。記錄了每只動物的肝臟重量或體重（圖1A和2B - C）。與對照組相比，MCD喂養組的體重和肝臟重量均有所下降。然而，蘇木酮A治療部分逆轉了這些效應并改善了它們。此外，中高劑量蘇木酮A治療組的體重和肝臟質量與水飛薊素治療小鼠相當（圖2B和C）。盡管如此，蘇木酮A治療并未影響MCD喂養小鼠的肝臟指數（圖2D）。為了評估蘇木酮A對肝功能的影響，通過收集小鼠的血清樣本測量了血清ALT和AST水平。我們觀察到蘇木酮A劑量依賴性地減輕了MASH小鼠的肝臟損傷，高劑量蘇木酮A治療小鼠的治療效果與水飛薊素治療小鼠相似（圖2E）。組織學（H&E）染色切片證明，中高劑量蘇木酮A給藥后，MCD喂養小鼠肝臟中MASH的嚴重程度顯著減輕（圖1F）。如圖1G所示，中高劑量蘇木酮A的注射顯著改善了肝臟組織中的脂肪變性程度、NAFLD活動評分和肝臟微炎癥，高劑量蘇木酮A治療的效果與水飛薊素相似。一致地，蘇木酮A治療減少了MASH肝臟中的肝細胞死亡（補充圖1B）。因此，蘇木酮A對MCD誘導的小鼠肝臟損傷具有肝保護作用。

3、mRNA - seq基因的生物信息學分析和SNP分析

在陰性對照（NC，ND處理組）、蘇木酮A（100 mg/kg）、MCD和MCD + 蘇木酮A（100 mg/kg）組中，共鑒定出15988個重疊基因（圖3A）。此外，在NC與MCD以及MCD與MCD + 蘇木酮A組之間篩選出201個共同的差異表達基因（DEGs）（logFC = 1，p adjust < 0.05）（圖3B）。主成分分析（PCA）顯示不同組之間有明顯的分離（圖3C）。此外，火山圖顯示與NC相比，MCD中有376個下調的DEGs和493個上調的DEGs（圖3D）。

此外，在MCD + 蘇木酮A與MCD相比，有249個DEGs下調，199個DEGs上調（圖3E）。基于這201個重疊的DEGs進行了KEGG、GO和GSEA分析。在NC和MCD組的比較中，GO術語主要映射到脂質代謝過程、免疫系統過程和膠原纖維組織，而KEGG術語映射到PI3K - Akt、過氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR）和MAPK途徑（圖3F）。相反，在MCD和MCD + 蘇木酮A組之間，GO術語主要與脂質代謝過程、免疫系統過程、細胞外基質（ECM）和胰島素受體活性有關，而KEGG術語則集中在PPAR信號通路和炎癥相關途徑上（圖3G）。

4、蘇木酮A抑制MASH小鼠的肝內脂肪生成

鑒于脂質代謝過程在MASH病理生理學中的關鍵作用，我們接下來驗證了蘇木酮A治療是否影響MCD喂養小鼠的脂質代謝。切片的油紅O染色證明，在給予中高劑量蘇木酮A后，MCD喂養小鼠肝臟中異常的脂滴積累顯著改善（圖4A和B）。一致地，肝臟TG和TC含量也表現出類似模式（圖4C和D）。然而，低濃度蘇木酮A對減少脂質積累沒有顯著影響。與MCD組相比，GSEA表明蘇木酮A治療抑制了肝臟脂質儲存、脂質生物合成過程（圖4E和F）。

5、蘇木酮A抑制肝臟脂質合成并促進脂質代謝

如圖5A和B所示，與對照組相比，在MCD喂養小鼠中觀察到脂肪生成相關基因表達升高以及脂肪酸β - 氧化相關基因表達降低，而蘇木酮A治療逆轉了這些效應。此外，蘇木酮A治療顯著增加了脂肪酸分解相關基因的表達，包括細胞色素P450（Cyp）2e1、Cyp3a11和Cyp4a10，在MASH模型中（圖5C）。同樣，DEGs的熱圖進一步證實了蘇木酮A對MCD飲食誘導的脂肪變性的抑制效應（圖5D）。因此，這些發現表明蘇木酮A抑制肝臟脂質合成并促進脂質代謝，從而減輕MASH的嚴重程度。

6、蘇木酮A治療減輕MCD誘導的小鼠肝臟纖維化

異常的肝臟膠原蛋白積累會導致肝臟纖維化、僵硬和終末期肝病，這些是MASH最常見的致命肝臟后果。預防肝臟纖維化是為治療MASH而設計的現代治療方案的目標之一。隨后，我們確定蘇木酮A是否對MASH肝臟具有抗纖維化作用。

如圖6A和B所示，西瑞紅染色顯示，在MCD + 蘇木酮A處理的小鼠中，肝臟纖維化有顯著改善，其纖維間隔比接受載體處理的MCD喂養小鼠更窄。GSEA進一步揭示了蘇木酮A治療增強了膠原蛋白代謝過程（圖6C）。同樣，DEGs的熱圖也進一步證實了蘇木酮A的抗纖維化效應（圖6D）。一致地，蘇木酮A治療減輕了纖維化組織中促纖維化基因的表達，包括α - 平滑肌肌動蛋白（αSMA）、Ⅰ型膠原蛋白（Col1）、Ⅳ型膠原蛋白（Col4）、金屬蛋白酶 - 1（TIMP1）和轉化生長因子- β（TGFβ）（圖6E）。總體而言，蘇木酮A在MASH小鼠中表現出抗纖維化特性。

7、蘇木酮A改善MASH小鼠的肝臟炎癥

為了研究蘇木酮A在肝臟炎癥中的作用，通過免疫組化染色觀察到與對照組相比，MASH肝臟中CD86 + 或F4 / 80 + 巨噬細胞的數量增加，這一現象可通過蘇木酮A劑量依賴性地逆轉（圖7A - D）。qRT - PCR分析進一步支持了這些結果（補充圖7A），蘇木酮A治療顯著降低了相關炎癥因子（腫瘤壞死因子α（TNFα）、IL - 1β和IL - 6）的mRNA表達水平（圖7E）。在ELISA中也觀察到這些炎癥因子的類似結果（圖7F）。此外，蘇木酮A治療還降低了MASH環境中CXCL10在肝臟中的表達水平（補充圖7B）。一致地，轉錄組測序結果顯示，在MCD喂養的小鼠中，蘇木酮A治療后炎癥反應下調（圖7G）。所有這些數據表明蘇木酮A可以顯著減輕MASH小鼠的肝臟炎癥反應。

8、蘇木酮A減少代謝應激下肝細胞的脂質積累

為了進一步確認蘇木酮A是否可以直接減少肝細胞中的脂質積累，使用PA構建了一個體外脂毒性模型。與對照小鼠相比，模型小鼠中觀察到的升高的LDH含量反映了PA的脂毒性，而蘇木酮A（10和100μM）治療改善了PA誘導的細胞損傷（圖8A）。我們還使用Bodipy熒光染料來展示細胞內脂質含量，發現蘇木酮A治療減輕了PA在肝細胞中產生的過度脂質沉積（圖8B和C）。此外，蘇木酮A還降低了PA處理的肝細胞中的TG和TC水平（圖8D）。值得注意的是，相關脂肪生成基因的mRNA表達水平也表現出類似模式（圖8E）。因此，這些發現表明蘇木酮A可以直接抑制代謝功能障礙環境下的肝細胞中的脂肪生成。

9、蘇木酮A通過Mup3抑制PA誘導的AML12小鼠肝細胞脂肪生成

為了探索蘇木酮A調節MASH肝臟中脂肪分解的機制，進行了轉錄組測序分析。篩選出NC與MCD組以及MCD與MCD + 蘇木酮A組之間差異最顯著的前20個重疊的DEGs。有趣的是，載脂蛋白Mup3的表達水平在MASH肝臟中顯著降低，而蘇木酮A治療恢復了這一變化（圖9A）。Western blot也揭示了相同的模式（圖9B和C）。我們進一步檢查了鋅指和同源盒2（Zhx2）的表達水平，Zhx2是Mup3的關鍵調節因子（Jiang等，2017），發現經蘇木酮A治療的MCD處理組中Zhx2表達增加（圖9D），這與Mup3的表達一致，進一步證實了Mup3信號通路。此外，PA降低的Mup3表達在肝細胞中部分被蘇木酮A治療逆轉（圖9E）。根據這些觀察，我們推測蘇木酮A的抗脂肪肝效應可能是通過靶向Mup3實現的。

為了驗證上述推測，我們使用siRNA沉默AML12肝細胞中Mup3的表達。干擾效率如圖9F所示，敲低效率超過60%。值得注意的是，Mup3敲低部分消除了蘇木酮A提供的脂肪分解效應，這通過脂肪生成基因水平的增加（圖9G）以及TG和TC（圖9H）得到證實。此外，Bodipy熒光染色表明，沉默Mup3增加了脂質含量，并減少了蘇木酮A對肝細胞脂質形成的影響（圖9I - J）。綜上所述，這些結果表明Mup3對于蘇木酮A誘導的肝細胞中脂質積累的抑制是必不可少的。

【結論】

MASH的肝臟表現包括代謝功能障礙和肝臟病理之間的復雜相互作用，涉及肝臟脂肪變性、炎癥和纖維化。在本研究中，數據顯示了MASH小鼠明顯的肝臟并發癥，包括肝臟脂肪變性和脂肪生成（圖4和5）、肝臟纖維化（圖6）和炎癥（圖7），這表明成功構建了MASH小鼠模型。然而，針對MASH最有效的藥物療法仍然難以捉摸。吡格列酮是APASL推薦的特定療法之一，改善了MASH患者的肝臟組織病理學，包括肝臟脂肪變性、氣球樣壞死和炎癥。因此，針對進展性MASH的治療藥物開發存在未滿足的醫療需求。

我們發現蘇木酮A治療減輕了MASH模型中的這些肝臟并發癥（圖4-7）。水飛薊素已被證明可以阻礙MASH的進展。高劑量蘇木酮A治療表現出與水飛薊素相似的效果（圖2、4和6），這表明蘇木酮A具有作為MASH治療選擇的潛力。在本研究中，我們發現蘇木酮A有效地限制了肝細胞中的脂質積累和脂毒性，至少部分是通過靶向Mup3，從而抑制小鼠中MASH的發展。本研究的新穎之處在于探索了蘇木酮A及其在MASH小鼠模型中可能的機制，為尋找有效的治療藥物提供了新的見解。

肝細胞負責肝臟的主要代謝功能。為了為這些生理活動提供能量，肝細胞吸收和利用大量的脂質，包括游離脂肪酸和脂蛋白殘余物。肝細胞是肝臟中儲存甘油三酯的主要細胞，也是MASLD中積累脂質的細胞。在MASLD患者中，脂質的攝取和合成超過了通過消耗和排泄的通量，導致肝細胞中脂質過度沉積，最終誘導細胞脂毒性。脂毒性是MASLD和MASH的主要因素之一，其特征是在肝細胞的細胞質中積累有毒脂質，導致細胞器功能障礙、細胞損傷，最終導致脂肪細胞凋亡。

Mups作為一種脂質載體蛋白超家族，被認為在運輸親脂性分子和調節細胞穩態方面具有雙重分子功能。值得注意的是，Mups在介導這些脂質分子的運輸中起著重要作用。研究表明，用重組Mup1治療雄性糖尿病小鼠可降低血清甘油三酯和胰島素水平，并減少骨骼肌中的脂質積累。一致地，AM251，一種CB1R拮抗劑，通過在肝細胞中產生Mup1，減輕了游離脂肪酸誘導的胰島素信號磷酸化的損傷。值得注意的是，包括Mup3在內的幾種Mups在MASLD小鼠的血清和肝臟組織中減少，而Mups補充顯著減輕了疾病條件下的內質網應激和胰島素抵抗。從我們的發現中注意到，敲低肝細胞中Mup3的表達顯著加劇了脂質沉積。Zhx2被發現是Mup3的關鍵調節因子，我們驗證了在MASH小鼠模型中，蘇木酮A治療后Zhx2的表達增加。這一觀察與Mup3的表達水平一致，進一步證實了Mup3信號在介導蘇木酮A的肝保護中的作用。

包括肝細胞脂毒性、氧化應激、胰島素抵抗和腸道菌群失調在內的眾多因素促成了肝臟炎癥反應。肝臟巨噬細胞，包括浸潤的單核細胞衍生巨噬細胞和駐留的庫普弗細胞（KCs），已被確定在MASH的炎癥過程中發揮關鍵作用。巨噬細胞極化是影響MASH進展的關鍵因素，M1和M2代表巨噬細胞的兩種極化狀態，分別通過促炎和抗炎活性在體內維持穩態。MASH患者促炎細胞因子和趨化因子水平升高。TNFα、IL - 1β和IL - 6等促炎細胞因子在MASH的背景下發揮多種作用。這些細胞因子的分泌延長了免疫反應，并促進了中性粒細胞和巨噬細胞向損傷部位的補充。這一過程加劇了炎癥反應，并形成了惡性循環。此外，某些細胞因子誘導HSCs分化成產生大量細胞外基質的肌成纖維細胞，最終導致纖維化。此外，這些細胞因子在放大脂肪組織內的炎癥級聯反應中起著關鍵作用，從而導致胰島素抵抗并促進脂質積累。趨化因子，包括CCL2和CXCL10，在MASH中加劇炎癥和纖維化，并促進免疫細胞的肝臟浸潤。

我們團隊之前的研究發現蘇木酮A可以抑制急性肝損傷中的肝臟炎癥和肝纖維化。在本實驗中，我們首次證實蘇木酮A減輕了受損小鼠肝臟中巨噬細胞的浸潤，并抑制了M1型巨噬細胞的極化。此外，受損小鼠肝臟中肝臟TNFα、IL - 1β和IL - 6的表達升高。MASH小鼠肝臟中CCL2和CXCL10的表達表現出相同的趨勢。值得注意的是，蘇木酮A降低了MASH小鼠中這些肝臟炎癥因子。然而，蘇木酮A在MASH中的抗炎作用尚未研究，這構成了本研究的局限性。因此，需要進一步的研究來更清晰地闡明蘇木酮A在KCs中與MASH相關的肝臟炎癥中的作用。

在本研究中，我們證明了蘇木酮A至少部分通過上調肝細胞中Mup3的表達來減輕MASH。然而，轉錄組測序中受蘇木酮A影響的前20個重疊基因，包括Semaphorin 3b（Sema3B）、GIPC PDZ結構域含家族成員2（Gipc2）以及CD63，可能在MASH進展中發揮作用。最近的一項研究發現，Sema3B通過促進M2 - 巨噬細胞極化減少促炎細胞因子的分泌，在骨關節炎模型中發揮作用。相反，先前的一項研究報告稱Sema3B可以促進IL - 18的產生并增加腫瘤微環境中M1 - 巨噬細胞的募集。已有文獻記載Gipc2參與腫瘤細胞凋亡和免疫細胞浸潤。CD63，也稱為溶酶體相關膜蛋白3。CD63敲低抑制了RAB37介導的人脂肪源性間充質干細胞的脂肪生成分化。除了介導脂肪生成外，CD63還能夠調節凋亡。抑制CD63的表達阻斷了人腎小管上皮細胞的細胞凋亡。由于這些結果表明這三個基因參與了MASH的進展，我們進一步驗證了Sema3B、Gipc2和CD63的基因表達在MASH模型中顯著上調，但在蘇木酮A給藥后降低。然而，這三個基因作用的具體機制尚未探索，這代表了本研究的局限性。因此，后續研究應進行以探索Sema3B、Gipc2和CD63在MASH發病機制中的具體作用。此外，MAPK信號通路被PharmMapper服務器預測為蘇木酮A的潛在靶向通路。我們的數據還顯示MAPK通路在MASH小鼠肝臟中被激活，而蘇木酮A治療改變了這一趨勢，表明蘇木酮A提供的肝保護可能部分通過調節MAPK信號通路實現。

總之，我們的數據描繪了蘇木酮A作為MASH保護劑的潛在功能。如圖9K所示，蘇木酮A通過上調肝細胞中Mup3的表達抑制脂質沉積，從而減少脂毒性、肝臟炎癥和纖維化，這導致了MASH進展的減輕。因此，蘇木酮A有潛力成為MASH的新型治療劑。

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