南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院姜平教授團隊于2025年1月發(fā)表在ACS NANO雜志上名為“Nanoparticle Vaccine Triggers Interferon Gamma Production and Confers Protective Immunity against Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus”（納米顆粒疫苗觸發(fā)IFN-γ的產(chǎn)生并賦予對PRRSV的保護(hù)性免疫）的文章，在這項研究中，作者在PRRSV NADC30-like毒株的結(jié)構(gòu)蛋白中鑒定了7個能夠誘導(dǎo)IFN-γ產(chǎn)生的短肽。隨后利用SpyCatcher-SpyTag系統(tǒng)設(shè)計了三種基于這些肽的重組抗原，并將其展示在鐵蛋白納米顆粒表面，形成了三種不同的自組裝納米顆粒，免疫后在小鼠和豬體內(nèi)引發(fā)了強烈的PRRSV特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)。為防控PRRSV提供了一種有前景的候選疫苗，并證實了納米顆粒蛋白作為下一代PRRSV疫苗開發(fā)平臺的實用性。

豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)每年給養(yǎng)豬業(yè)造成重大經(jīng)濟損失。由于現(xiàn)有的商業(yè)疫苗對流行性PRRSV的保護(hù)作用有限，因此迫切需要創(chuàng)新的解決方案。通常，在病毒感染后，體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答之間的協(xié)作對于病原體的抑制和清除是必不可少的。然而，細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)的作用因特定病毒而異。例如，體液免疫反應(yīng)對于預(yù)防和消除猴痘病毒和豬圓環(huán)病毒引起的感染至關(guān)重要。相反，對于一些引起長期感染的病毒，如PRRSV，體液免疫反應(yīng)的效力有限，而細(xì)胞免疫反應(yīng)起主要作用。因此，設(shè)計能夠有效誘導(dǎo)針對PRRSV的特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答的疫苗是下一代疫苗研究的首要目標(biāo)。特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答依賴于相應(yīng)的T細(xì)胞表位。因此，確定相關(guān)的T細(xì)胞表位并在此基礎(chǔ)上設(shè)計重組蛋白是產(chǎn)生誘導(dǎo)特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)的疫苗的有效策略，這種方法最近已應(yīng)用于SARS-CoV-2疫苗的開發(fā)。

納米顆粒疫苗可誘導(dǎo)強大的免疫應(yīng)答，已成為疫苗開發(fā)的一個有前景的方向。研究表明，基于鐵蛋白的納米顆粒可以引發(fā)針對多種病毒的保護(hù)性免疫。這種細(xì)菌蛋白是天然的、無毒的、耐熱的，可以用簡單、快速、廉價的方法制備，可以按比例進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)。SpyCatcher-SpyTag系統(tǒng)可以方便、高效地將蛋白抗原裝載到納米顆粒表面，從而可以直接、快速地生產(chǎn)重組納米顆粒。

因此在這項研究中，作者設(shè)計并生產(chǎn)了一種自組裝的鐵蛋白納米顆粒疫苗來對抗流行性PRRSV。動物實驗表明，三種納米顆粒的混合物在小鼠和豬體內(nèi)強烈引發(fā)PRRSV特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)，為對抗流行性PRRSV提供了一個有希望的候選疫苗。也為開發(fā)動物疫苗提供了一個實用平臺。

結(jié)果一：PRRSV結(jié)構(gòu)蛋白T細(xì)胞表位的分析與鑒定

IFN-γ是調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫應(yīng)答的重要細(xì)胞因子，在多種病毒感染的體內(nèi)控制和清除病原體中起著重要作用。為了鑒定PRRSV內(nèi)潛在的T細(xì)胞表位，作者使用NetMHCpan 4.1和IEDB分析了52個豬白細(xì)胞抗原(SLA)- I等位基因?qū)Υ罅餍蠵RRSV NADC30-like毒株結(jié)構(gòu)蛋白的抗性(圖1A)。分析得到4536個與SLA結(jié)合的短肽，長度為8到10個氨基酸。圖1B總結(jié)了結(jié)構(gòu)蛋白不同位置的預(yù)測得分，并顯示了潛在表位的分布。將rank小于0.5的SLA - 1結(jié)合肽歸類為候選表位，選擇58個肽進(jìn)行合成和實驗評價。

用PRRSV FJ1402對11頭豬進(jìn)行攻毒，在4周內(nèi)兩次攻毒，并在攻毒后28天和42天分離PBMCs，使用ELISpot分析PRRSV特異性IFN-γ分泌(圖1A)。由于PRRSV特異性IFN-γ分泌在接種后42天明顯高于接種后28天(圖1C)，因此在接種后42天收集PBMC進(jìn)行短肽合成刺激，以測試T細(xì)胞對抗原表位的反應(yīng)。在IFN-γ ELISpot篩選后，發(fā)現(xiàn)58個肽中的7個具有27.3%至72.7%的穩(wěn)健應(yīng)答率(表1)，并被進(jìn)一步分析為與IFN-γ產(chǎn)生相關(guān)的潛在T細(xì)胞表位。

為了更好地了解不同豬的PBMC在相同肽刺激下的不同反應(yīng)，作者克隆了11頭實驗豬的SLA-1基因并對其進(jìn)行了測序。圖1D的系統(tǒng)譜顯示，SLA-1基因分為4個不同的類群。這一結(jié)果突出了豬種群中SLA基因的多態(tài)性，并可能解釋為什么不同的豬PBMCs對相同肽的反應(yīng)不同。因此，在設(shè)計重組抗原以在盡可能多的豬中誘導(dǎo)特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答時，需要考慮廣泛的SLA基因型的覆蓋范圍。

圖1. PRRSV NADC30-like毒株結(jié)構(gòu)蛋白中T細(xì)胞表位的分析與鑒定

表1肽刺激ELISpot法檢測PBMCs中IFN-γ分泌

結(jié)果二：重組蛋白的設(shè)計、純化和表征

為了增強蛋白質(zhì)的免疫原性，作者用SpyCatcher-SpyTag系統(tǒng)生產(chǎn)自組裝納米顆粒，首先將設(shè)計的重組抗原通過柔性連接體與SpyCatcher蛋白融合，并在c端添加His和Strep標(biāo)簽以進(jìn)行純化(圖2A)。Alphafold預(yù)測的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)表明，重組抗原和SpyCatcher標(biāo)簽之間的距離可能足以在納米顆粒上進(jìn)行表面展示(圖2A)。隨后作者利用桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了GP3m-SpyCacher、GP4m-SpyCacher和GP5mSpyCacher三種重組蛋白(圖2B)。

SpyTag- Ferritin蛋白使用大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)，用作納米顆粒骨架蛋白(圖2C)。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測表明SpyTag位于鐵蛋白納米顆粒的表面，為與SpyCatcher的組裝提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)(圖2C)。ELISA結(jié)果表明，純化的重組蛋白GP3m-SpyCacher、GP4mSpyCacher和GP5m-SpyCacher能與豬血清反應(yīng)，而Spytag -鐵蛋白則不能(圖2D)。

圖2.重組抗原的設(shè)計、純化和鑒定

結(jié)果三：鐵蛋白納米顆粒的組裝與表征

通過優(yōu)化蛋白表達(dá)和純化條件，制備純化的重組蛋白并在體外組裝(圖3A)。蛋白- spycatcher和SpyTag-Ferritin在4℃孵育前按不同的摩爾比混合，通過SDS-PAGE檢測蛋白的偶聯(lián)效率（圖3B）。然后使用SEC分析組裝的蛋白質(zhì)，以確認(rèn)它們是否可以以可溶性納米顆粒蛋白質(zhì)形式存在。SEC分析顯示，未組裝的SpyTag-Ferritin在洗脫過程中早期顯示單峰，表明該蛋白為聚合物形式(圖3C)。與此相反，組裝后的SpyTag-Ferritin和多余的Spycatcher-蛋白被洗脫為兩個主峰(圖3C)。洗脫的蛋白也用SDS-PAGE進(jìn)行了表征(圖3C)，并且用動態(tài)光散射(DLS)對SEC第一個峰洗脫的蛋白進(jìn)行了進(jìn)一步的分析 (圖3D)。然后用電鏡觀察蛋白質(zhì)共軛納米顆粒的結(jié)構(gòu)特征。如圖3E所示，未組裝的Spytag -鐵蛋白納米顆粒樣品中有許多形狀均勻的顆粒狀物體，邊緣相對光滑，而蛋白質(zhì)共軛鐵蛋白納米顆粒表面粗糙，有小突起。結(jié)合SEC, DLS和TEM數(shù)據(jù)，作者證實了蛋白質(zhì)-SpyCatcher成功組裝Spytag -鐵蛋白納米顆粒表面。

此外，蛋白質(zhì)-鐵蛋白納米顆粒表現(xiàn)出優(yōu)異的穩(wěn)定性，經(jīng)過五次凍融循環(huán)后，蛋白質(zhì)-鐵蛋白納米顆粒的穩(wěn)定性仍未受到影響(圖4A)。在不同儲存條件下的測試顯示，在4°C條件下1周或- 20°C條件下6個月后，其溶解度、Rd或PDI沒有顯著變化(圖4B)。SDS-PAGE分析證實了沒有降解帶(圖4C)。

圖3.鐵蛋白納米顆粒的組裝與表征

圖4.三種鐵蛋白納米顆粒的穩(wěn)定性試驗

結(jié)果四：FeCocktail疫苗在小鼠體內(nèi)引發(fā)強烈的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)

作者分別用蛋白- Spycatcher (5μg)、蛋白- Spycatcher混合物(由GP3m-SpyCatcher、GP4m-SpyCatcher和GP5m-SpyCatcher按1:1:1的質(zhì)量比混合而成，每種成分5 μg)、蛋白-鐵蛋白(5 μg)、蛋白-鐵蛋白混合物(將GP3m-Fe、GP4m-Fe和GP5m-Fe按1:1:1的質(zhì)量比混合制成，更名為FeCocktail)免疫5只小鼠。3周后用相同劑量的免疫原加強免疫，加強3周后收集血清(圖5A)。結(jié)果顯示鐵蛋白納米顆粒比可溶性單體蛋白引發(fā)了更強的體液免疫反應(yīng)，這可以通過更高水平的GP3m、GP4m和GP5m抗體來證明(圖5B - D)。一致地，淋巴細(xì)胞增殖試驗表明，與單體蛋白免疫相比，鐵蛋白納米顆粒免疫后淋巴細(xì)胞活化更有效(圖5F)，證實了納米顆粒蛋白有效激活小鼠免疫系統(tǒng)。

隨后作者對FeCocktail的成分也進(jìn)行了測試，以研究它們在誘導(dǎo)體液免疫反應(yīng)時是否相互干擾。結(jié)果顯示，針對FeCocktail和相應(yīng)的蛋白-鐵蛋白免疫組產(chǎn)生的抗體水平?jīng)]有顯著差異(圖5B - D)，表明沒有可檢測到的交叉干擾。但是在兩次FeCocktail疫苗免疫后，小鼠雖然觀察到強烈的體液免疫反應(yīng)，但在小鼠血清中無法檢測到中和抗體(圖5E)。

加強免疫三周后，分離小鼠脾臟的單細(xì)胞懸液，用Cocktail蛋白刺激。使用流式細(xì)胞術(shù)評估每種特定細(xì)胞類型的細(xì)胞因子分泌，研究結(jié)果表明，F(xiàn)eCocktail疫苗顯著增加了分泌IL-4和IFN-γ的CD3+CD4+細(xì)胞的比例和數(shù)量(圖5G?J)。CD3+CD4+細(xì)胞分泌IL-4和IFN-γ的同時升高表明FeCocktail疫苗免疫誘導(dǎo)了Th1和Th2的平衡免疫反應(yīng)。由于PRRSV特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞對病毒清除至關(guān)重要，接下來作者分析了CD3+CD8+ T細(xì)胞的活化。與單體蛋白相比，F(xiàn)eCocktail顯著增強了抗原特異性多功能CD8+ T細(xì)胞的活化，表現(xiàn)為CD8+ T細(xì)胞釋放IFN-γ和IL-2的比例和數(shù)量顯著增加(圖5H?J)。此外，如圖5K所示，與Cocktail單體蛋白疫苗相比，F(xiàn)eCocktail疫苗誘導(dǎo)CD8+中樞記憶T細(xì)胞和CD4+和CD8+效應(yīng)記憶T細(xì)胞的數(shù)量顯著增加。這些發(fā)現(xiàn)表明FeCocktail疫苗具有強大的免疫原性，可在小鼠體內(nèi)有效誘導(dǎo)強大的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)。

圖5.FeCocktail疫苗在小鼠體內(nèi)引起強烈的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)

結(jié)果五：FeCocktail疫苗在仔豬中誘導(dǎo)強烈的免疫應(yīng)答

由于PRRSV對豬肺泡巨噬細(xì)胞表現(xiàn)出特異性的趨向性，并在感染豬體內(nèi)誘導(dǎo)免疫抑制，因此作者在豬身上評估了FeCocktail疫苗的免疫原性。將25頭未感染PRRSV、ASFV、CSFV和PCV2的健康仔豬分為5組進(jìn)行免疫，3周后進(jìn)行加強免疫(圖6A)。兩次免疫后。納米顆粒疫苗在仔豬中誘導(dǎo)了有效的免疫應(yīng)答，GP3和GP5特異性抗體水平顯著增加，而抗Gp4蛋白抗體未檢測到(圖6B - D)。用GP3m-Fe和FeCocktail蛋白免疫后，淋巴細(xì)胞也出現(xiàn)增殖(圖6G)。與小鼠實驗結(jié)果一致，免疫仔豬血清中未檢測到中和抗體(圖6E)。

IFN-γ已被確定為豬PRRSV感染和清除的關(guān)鍵細(xì)胞因子。為了評估接種后IFN-γ的效果，作者在接種3周后收集免疫仔豬的PBMC，用純化的PRRSV FJ1402體外刺激，檢測特異性IFN-γ的產(chǎn)生。ELISpots分析顯示，F(xiàn)eCocktail蛋白免疫仔豬可有效刺激PRRSV特異性IFN-γ的產(chǎn)生(圖6F)。值得注意的是，IFN-γ的產(chǎn)生主要歸因于GP3m-Fe和GP5m-Fe蛋白(圖6F)。細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色證實了ELISpot的結(jié)果(圖6H)。

圖6. FeCocktail疫苗在仔豬中的免疫原性

結(jié)果六：FeCocktail疫苗可有效減輕感染仔豬的臨床癥狀并加速病毒清除

根據(jù)加強免疫后檢測到的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答，選擇FeCocktail蛋白免疫組進(jìn)行攻毒，評估其對病毒感染的保護(hù)作用。結(jié)果顯示，接種FeCocktail蛋白的仔豬在攻毒后3周內(nèi)保持正常體溫(<40°C)，而接種PBS的仔豬在攻毒后10天內(nèi)出現(xiàn)持續(xù)發(fā)熱(圖7A)。此外，F(xiàn)eCocktail蛋白免疫組與對照組相比，臨床癥狀明顯減輕，主要是在食欲、精神狀態(tài)和呼吸狀況方面(圖7B)。在試驗期間，接種FeCocktail蛋白的仔豬的日增重與健康仔豬無顯著差異，而PBS組的日增重因發(fā)燒和食欲下降等癥狀而降低(圖7C)。總之，這些臨床指標(biāo)表明FeCocktail蛋白對仔豬PRRSV感染具有有效的保護(hù)作用。此外，F(xiàn)eCocktail蛋白免疫顯著降低了感染后7天和14天血清中的病毒載量，并且在感染后21天檢測不到病毒(圖7D)。這表明FeCocktail蛋白免疫加速了PRRSV從血液中的清除，縮短了病毒血癥的持續(xù)時間。

隨后，作者從攻毒仔豬身上收集肺組織樣本進(jìn)行組織病理學(xué)染色。結(jié)果顯示FeCocktail蛋白免疫可顯著減輕肺組織損傷，肺間質(zhì)形態(tài)變化不明顯(圖7E和圖7F)。此外，F(xiàn)eCocktail蛋白免疫仔豬肺組織中的病毒載量也顯著低于PBS免疫仔豬肺組織中的病毒載量(圖7G)。這些結(jié)果表明FeCocktail蛋白對仔豬同源PRRSV具有保護(hù)作用。

圖7. FeCocktail疫苗對仔豬的保護(hù)性免疫

在這項研究中，作者開發(fā)了新的多表位重組蛋白抗原，并測試了它們作為PRRSV疫苗的有效性。利用SpyCatcher-SpyTag系統(tǒng)將重組蛋白展示在鐵蛋白納米顆粒表面，并與佐劑聯(lián)合免疫小鼠和豬。作者的研究證實，重組納米顆粒在接種疫苗的動物中有效地引發(fā)了強大的特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)，并對同源PRRSV毒株提供了免疫保護(hù)。總之，作者的研究結(jié)果為研制通用PRRSV疫苗奠定了基礎(chǔ)，并為下一代疫苗的設(shè)計策略提供了有價值的見解。

原文鏈接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acsnano.4c12212?goto=supporting-info

來源：ZhaoSunLab

編輯：吃一口小貓