玉米肽由于其獨特的氨基酸組成而具有良好的醒酒護肝腦作用，國內外眾多學者對玉米肽醒酒護肝機制在動物和細胞分子水平已經開展了一系列的研究，但玉米肽對受損神經系統的修復作用以及對酒精性腦損傷的細胞保護機制還缺乏相應的研究，因此從乙醇中毒機制出發，開發找到阻斷相應靶點緩解乙醇神經毒性的天然、無毒、營養的活性肽類食品是目前學者們關注和研究的熱點。

齊齊哈爾大學食品與生物工程學院的林巍、韓思琪、劉曉蘭等從氧化應激、炎癥相關、神經營養因子、突觸可塑性相關蛋白等方面在細胞水平上初步探討了玉米肽對酒精損傷神經細胞的保護作用及機制，以期為研制出具有神經保護活性的活性肽類食品提供一定的參考依據。

01

PC12細胞酒精損傷模型的建立

1.1 乙醇對細胞PC12存活率的影響

設立了終濃度為300、400、500、600 mmol/L的含乙醇培養基培養24 h，以篩選出酒精損傷細胞的最佳條件。如圖1所示，與對照組相比，4 種含有不同濃度乙醇的培養基中細胞存活率隨著乙醇濃度的不斷升高而逐漸降低，與乙醇濃度呈反比關系。當乙醇濃度為300 mmol/L時，細胞的存活率為（81.04±2.22）%，細胞的受損程度較輕，細胞形態變化不明顯；當乙醇濃度為400 mmol/L時，細胞的存活率為（68.06±3.86）%，與對照組相比具有顯著差異（

P

＜ 0.05 ），此時細胞損傷程度適中，部分細胞神經突起回縮，貼壁效果一般；乙醇濃度為 500 mmol/L 時，存活率為（ 56.80 ± 2.64 ） % ，受損細胞數量明顯上升，細胞形態發生較大改變，大部分細胞漂浮在培養基中；而當乙醇濃度為 600 mmol/L 時，存活率為（ 26.87 ± 1.80 ） % ，細胞貼壁性極差，細胞開始大范 圍死亡，不適宜用于模型的建立。

1.2乙醇對細胞PC12細胞形態及細胞核的影響

由圖2A可知，在光學顯微鏡下觀察到，對照組中PC12細胞排列分布規則，生長狀態良好，細胞之間連接緊密且細胞數目較多；與對照組相比，模型組中細胞的形態發生了較為明顯的變化，可見細胞與細胞之間縫隙變大，神經突起回縮，細胞貼壁性較差且有脫落現象，部分細胞胞體變小，形態固縮，細胞膜完整性喪失甚至出現破裂，有部分細胞碎片，表明乙醇作用使細胞形態發生了顯著變化，導致細胞嚴重損傷。采用Hoechst33258染色法觀察到的乙醇對細胞核形態的影響見圖2B，正常對照組中PC12細胞的形態完整，藍色熒光均勻呈現于細胞核內，與對照組相比，模型組（400 mmol/L）中PC12細胞中發出亮藍色熒光的細胞數量明顯增多，部分細胞出現不同程度的核固縮變形或破裂，表明乙醇對PC12細胞具有損傷作用，導致細胞存活率下降。核萎縮和染色質濃縮是神經元細胞死亡途徑的主要事件，也被認為是神經元退化的早期標志。以上結果表明400 mmol/L乙醇對PC12細胞具有顯著影響，結合存活率，選擇400 mmol/L為酒精損傷最適濃度，并以此建立酒精損傷模型開展后續實驗。

02

玉米肽對酒精損傷PC12細胞的保護作用

利用前期建立的PC12酒精性損傷模型，研究玉米肽對酒精損傷PC12細胞的保護作用。從圖3可以看出，與對照組相比，酒精損傷模型組細胞損傷嚴重，細胞存活率為（64.46±1.82）%，顯著降低（

P

＜ 0.05 ），而預先加入玉米肽處理的細胞，細胞存活率均顯著高于酒精模型組（

P

＜ 0.05 ）。在玉米肽質量濃度較低（ 25 μg /mL ）時，細胞存活率顯著上升至（ 68.59 ± 1.82 ） % ，即對酒精損傷 PC12 細胞表現出顯著的保護效果（

P

＜ 0.05 ），且隨著質量濃度的升高，玉米肽對 PC12 細胞存活率的影響越加明顯，這表明玉米肽對乙醇誘導損傷的 PC12 細胞具有保護作用，并具有劑量依賴性。從中選取量效關系較好的 3 個玉米肽質量濃度（ 25 、 100 、 400 μg /mL ）進行后續實驗，進一步 探討玉米肽對酒精損傷神經細胞的保護機制。

03

玉米肽對酒精損傷細胞氧化應激相關指標的影響

3.1 玉米肽對酒精損傷細胞中GSH濃度的影響

從圖4可以發現，與對照組相比，酒精損傷模型組細胞內GSH水平顯著降低（

P

＜ 0.05 ）。玉米肽預處理細胞后再用乙醇誘導細胞損傷，在實驗質量濃度范圍下，細胞內 GSH 水平呈上升趨勢，表明玉米肽對乙醇誘導氧化損傷的細胞內 GSH 水平下降表現出了積極的調節作用。該實驗結果與前期小鼠實驗結果一致，無論是動物實驗還是細胞實驗，玉米肽皆可提高神經細胞中 GSH 的濃度。這種調節作用在其他細胞中也被證實，Wang Liying等研究了玉米肽對人肝癌細胞內GSH和活性氧水平的調控作用，結果表明玉米肽可以提高H2O2誘導損傷細胞的抗氧化能力及GSH水平，推測玉米肽這種作用與其自身具備較好的抗氧化活性密不可分。

3.2玉米肽對酒精損傷細胞中MDA濃度的影響

從圖5可以看出，與對照組相比，模型組PC12細胞內MDA濃度升高了87%，與對照組差異顯著（

P

＜ 0.05 ），表明乙醇誘導細胞損傷時，促進了細胞中脂質過氧化物 MDA 的生成。與酒精損傷模型組相比，玉米肽 25 、 100 、 400 μg /mL 劑量組中 MDA 濃度均顯著減少（

P

＜ 0.05 ），具有一定的劑效關系，其中 400 μg /mL 劑量組效果最好， MDA 濃度下降了 34.56% ，這表明玉米肽能降低酒精損傷 PC12 細胞內的 MDA 生成量，抑制細胞的過氧化，本實驗室前期動物實驗也表明玉米肽能夠降低大鼠酒后腦組織細胞中 MDA 的濃度。

3.3玉米肽對酒精損傷細胞中SOD質量濃度的影響

從圖6可知，與對照組相比，模型組PC12細胞中SOD質量濃度顯著下降（

P

＜ 0.05 ）。模型組 PC12 細胞中 SOD 質量濃度相較于對照組下降了 45.29% ，表明乙醇可使細胞內 SOD 質量濃度降低，導致活性下降。乙醇處理后，脂質過氧化物的大量生成，從而抑制了 SOD 活性。而預先加入不同玉米肽處理后的細胞內 SOD 質量濃度均顯著高于模型組（

P

＜ 0.05 ），表明玉米肽能夠緩解酒精損傷導致的細胞內的 SOD 水平下降。有報道發現玉米肽可以提高體外酒精損傷肝細胞模型細胞內SOD活力。因此玉米肽對細胞內的SOD活性具有調節作用。

04

玉米肽對酒精損傷細胞炎癥反應相關指標的影響

4.1玉米肽對酒精損傷細胞中TNF-α質量濃度的影響

如圖7所示，與對照組相比，模型組細胞內TNF-α質量濃度顯著升高（

P

＜ 0.05 ），表明乙醇促進了細胞中 TNF- α 合成或分泌。與酒精損傷模型組相比，玉米肽 25 、 100 、 400 μg /mL 劑量組 PC12 細胞中 TNF- α 質量濃度均顯著減少（

P

＜ 0.05 ），且呈量效關系，其中 400 μg /mL 劑量組效果最好。實驗結果表明，玉米肽預處理能顯著降低酒精損傷 PC12 細胞中 TNF- α 水平，減少炎癥反應發生，緩解 乙醇對神經細胞的損傷。

4.2玉米肽對酒精損傷細胞中IL-6質量濃度的影響

從圖8可以看出，與對照組相比，酒精損傷模型組PC12細胞內IL-6質量濃度顯著升高（

P

＜ 0.05 ），表明乙醇誘導細胞損傷提高了 IL-6 水平。與酒精損傷模型組相比，玉米肽 25 、 100 、 400 μg /mL 劑量組中 IL-6 質量濃度均顯著減少（

P

＜ 0.05 ），表明玉米肽可以降低酒精損傷細 胞中炎性因子含量，緩解乙醇對細胞的損傷。

4.3玉米肽對酒精損傷細胞中NF-κB質量濃度的影響

玉米肽對酒精誘導PC12細胞損傷條件下細胞內NF-κB水平調節作用結果如圖9所示。與對照組相比，酒精損傷模型細胞內NF-κB質量濃度顯著升高（

P

＜ 0.05 ），表明乙醇誘導細胞損傷時促進了 NF- κ B 合成。與模型組相比，玉米肽質量濃度為 25 μg /mL 時細胞中 NF- κ B 質量濃度降低，但不顯著（

P

＞ 0.05 ），玉米肽 100 、 400 μg /mL 劑量組中 NF- κ B 質量濃度均顯著減少（

P

＜ 0.05 ），其中 400 μg /mL 劑量組效果最好，但仍未恢復到正常對照組水平，玉米肽對酒精損傷神經細胞內 NF- κ B 質量濃度的升高具有抑制作用。

05

玉米肽對酒精損傷細胞中神經營養因子的影響

5.1玉米肽對酒精損傷細胞中NGF質量濃度的影響

從圖10可以發現，與對照組相比，乙醇作用后的PC12細胞內NGF水平顯著降低（

P

＜ 0.05 ）。玉米肽預處理細胞后再用乙醇誘導細胞損傷，在實驗質量濃度范圍內，細胞內 NGF 水平均有所提高，接近對照組細胞內 NGF 水平，表明玉米活性肽預處理能夠提高酒精損傷 PC12 細胞中 NGF 質量濃度。

5.2玉米肽對酒精損傷細胞中BDFNF質量濃度的影響

從圖11可以看出，與對照組相比，乙醇作用PC12細胞后，模型組細胞內BDNF水平顯著降低（

P

＜ 0.05 ）。與模型組相比，玉米肽預處理后細胞內 BDNF 水平隨著玉米肽劑量增加顯著上升（

P

＜ 0.05 ），表明玉米肽可以增加受損細胞內的 BDNF 質 量濃度，修復受損神經細胞，保護酒精損傷的神經細胞。

06

玉米肽對酒精損傷細胞中突觸可塑性相關蛋白的影響

6.1玉米肽對酒精損傷細胞中SYN水平的影響

從圖12可以看出，與對照組相比，模型組細胞中突觸素（SYN）質量濃度下降了20.77%，與對照組差異顯著（

P

＜0.05），表明乙醇誘導細胞損傷降低了SYN水平。乙醇誘導PC12細胞損傷后，細胞代謝反應速率減緩，神經遞質轉運能力降低，使SYN水平下降。但使用玉米肽預處理后，在實驗范圍內，乙醇誘導損傷的細胞中SYN質量濃度未見顯著改善 。但本實驗未發現玉米肽對酒精損傷細胞中SYN水平的改善作用，表明其改善酒精性腦損傷的功能可能并不是通過提高細胞內SYN水平實現的。

6.2玉米肽對酒精損傷細胞中psd-95水平的影響

由圖13 可知，與對照組相比，模型組細胞中PSD-95水平顯著降低（

P

＜0.05）。玉米肽預處理細胞后再用乙醇誘導細胞損傷，發現在實驗質量濃度范圍下細胞內PSD-95水平呈上升趨勢，其中25 μ g /m L玉米肽組細胞中PSD-95水平變化不顯著（

P

＞0.05），100 μg/mL和400 μg/mL玉米肽組顯著升高（

P

＜0.05），但未恢復至正常水平。這表明玉米肽預處理的方式能夠增加酒精損傷PC12細胞內PSD-95的質量濃度，提示玉米肽可能通過上調PSD-95水平，參與突觸可塑性的調節，維持突觸信號傳遞這個重要過程，從而改善學習記憶功能。

6.3玉米肽對酒精損傷細胞中GAP-43水平的影響

從圖14可以看出，與對照組相比，當僅有乙醇作用PC12細胞時，細胞內GAP-43水平顯著降低（

P

＜ 0.05 ），表明乙醇可降低神經細胞中 GAP-43 含量，損傷神經細胞的功能。玉米肽預處理細胞后再用乙醇誘導細胞損傷，在實驗質量濃度范圍下，細胞內 GAP-43 水平呈上升趨勢，與模型組相比，各玉米肽組均顯著提高（

P

＜ 0.05 ），其中 400 μg /mL 玉米肽效果最好，可使 GAP-43 恢復至對照組水平。表明玉米肽預處理的方式能夠提高酒精損傷細胞內 GAP-43 含量，促進 PC12 細胞神經功能恢復，增強突觸可塑性。推測玉米肽對酒后神經細胞的保護作用可能與 GAP-43 蛋白含量恢復有關。

07

為了進一步明確玉米肽對腦組織及神經細胞的保護作用，本研究在細胞水平上繼續探討了玉米肽對酒精損傷PC12細胞的保護作用及可能機制。PC12細胞是大鼠腎上腺髓質嗜鉻瘤分化細胞株，具有神經內分泌細胞的一般特征，常被應用于研究腦損傷、神經元分化等相關神經系統疾病的模型，在結構和功能上與神經元有很多相似之處。結果顯示，在蛋白質量濃度為25～400 μg/mL范圍內，分子質量＜1 kDa的玉米肽可提高酒精損傷PC12細胞的存活率，并具有劑量依賴性。

本研究結果表明玉米肽可提高酒精損傷PC12細胞中GSH和SOD含量、抑制MDA的生成。這些結果提示玉米肽通過自身的較強的抗氧化活性抑制脂質過氧化，從而緩解乙醇導致的SOD活性下降，增加細胞的抗氧化能力，減輕自由基的對神經細胞的損傷作用。

本研究結果發現玉米肽可降低酒精損傷PC12細胞中炎癥因子TNF-α和IL-6的水平，抑制乙醇導致的NF-κB含量升高。NF-κB參與調節炎癥反應時，可與多種炎癥因子相互促進激活，導致組織過度炎癥反應及損傷[28]。玉米肽可能通過抑制NF-κB表達，從而降低多種炎癥因子的生成，也可能是通過抑制多種炎性因子的含量，從而調控NF-κB的合成，減輕細胞的炎癥反應，確切機制需要進一步的探討。

本研究結果顯示，與正常對照組相比，酒精損傷模型組PC12細胞中NGF和BDNF含量顯著降低。BDNF是參與大多數形式的突觸可塑性的關鍵神經營養因子，支持神經元的生長、生存、分化等。研究表明乙醇應激會導致神經細胞中BDNF表達和信號傳導的下降，影響突觸可塑性[31]。本研究中，乙醇作用后，PC12細胞中PSD-95、SYN和GAP-433 種突觸可塑性相關蛋白含量顯著降低。而玉米肽預處理能夠提高酒精損傷PC12細胞中NGF和BDNF含量，還可上調突觸可塑性相關蛋白PSD-95和GAP-43的含量，但對乙醇引起的SYN含量降低沒有調節作用。除此之外NGF還可以增加SOD在細胞內的含量，因此玉米肽對細胞中NGF含量的調節作用不但加快了神經細胞的修復，也可改善細胞內的氧化應激狀態。上述結果提示具有復雜結構的天然活性肽可能通過多靶點、多通路改善乙醇對神經細胞的損傷作用，這也與酒精損傷機體細胞的復雜機制相對應。

結論

玉米肽可以顯著改善乙醇導致的PC12細胞損傷，其主要作用機制是通過提高細胞抗氧化能力和減輕細胞的炎癥反應，從而降低乙醇對PC12細胞的損傷作用，同時還通過提高神經營養因子和突觸可塑性相關蛋白的水平，促進受損細胞的恢復和維持突觸可塑性，這將為研制出具有神經保護活性的活性肽類食品奠定理論基礎。

作者簡介

第一作者：

林巍，副教授，齊齊哈爾大學食品與生物工程學院教師，畢業于東北農業大學基礎獸醫專業，研究方向為食品中大分子生物學活性研究，主要是以細胞和動物模型評價各種生物大分子的生物學活性，如蛋白及肽類的免疫、醒酒、健腦、抗腫瘤等功能性作用及機制的研究。

本文《玉米肽對酒精損傷PC12細胞的保護作用及機制》來源于《食品科學》2024年45卷第21期194-202頁，作者：林 巍，韓思琪，劉曉蘭，許英一。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20240410-085。點擊下方閱讀原文即可查看文章相關信息。

實習編輯：南伊；責任編輯：張睿梅。點擊下方閱讀原文即可查看全文。圖片來源于文章原文及攝圖網

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