蝦肉作為一種重要食材，因含有豐富的蛋白質、維生素和礦物質等營養成分而廣受消費者喜愛。高營養、高含水量和相對活躍的蛋白酶使蝦在貯存和加工過程中極易發生腐敗和氧化，最終導致品質劣化。

青蝦（Macrobrachium nipponense）是我國主要的淡水養殖蝦類之一。課題組前期利用乳酸腸球菌發酵青蝦蝦肉得到高品質凝膠產品的同時，發現經發酵后產品中可溶性肽含量顯著升高（P＜0.05）。由微生物發酵產生的氨基酸及肽不僅可以改善食品的質地和風味，還具有很多生物活性功能。課題組前期研究發現，通過乳酸菌發酵可以促使蝦糜形成凝膠。然而，隨著發酵時間的延長，蝦糜蛋白的降解程度增加，同時可溶性肽含量上升。肌原纖維蛋白（MP）和肌漿蛋白（SP）是蝦肉中的主要蛋白質成分。

江蘇大學食品與生物工程學院的熊治渝、孫蘭靜、袁麗*等研究分別以蝦肉中的MP和SP為對象，接種乳酸腸球菌進行發酵處理，動態監測發酵過程中兩種蛋白的降解及其抗氧化活性變化，以期為新型蝦產品及抗氧化肽的開發提供新的思路。

1 發酵過程中蝦糜凝膠可溶性肽含量的變化

TCA-可溶性肽含量可以反映蛋白質的降解程度。如圖1所示，樣品中TCA-可溶性肽質量濃度隨發酵時間的延長而逐步增加，發酵24 h后發酵組顯著高于對照F0（

P

＜0.05），表明蛋白可能在內源性蛋白酶和微生物蛋白酶的作用下發生降解，生成小分子肽和氨基酸。與蛋白質相比，除了作為基礎營養物質，多肽還可能因具有其他生物活性，如抗氧化性、抗炎、抗菌及更高的消化率，而賦予食品更多的營養功效和更高的接受度。

2 蝦糜MP和SP在發酵過程中微生物數量的變化

如圖2所示，隨著發酵時間的延長，MP和SP中的菌落總數和乳酸菌數整體呈先上升后下降的趨勢。0 h時MP和SP的菌落總數分別為7.18（lg（CFU/mL））和7.14（lg（CFU/mL）），兩者之間無顯著差異（

P

＞0.05），乳酸菌數分別為7.10（lg（CFU/mL））和7.13（lg（CFU/mL））（P＞0.05）。發酵12 h后，微生物數量迅速增加，MP和SP菌落總數分別增加了1.41、1.17（lg（CFU/mL）），乳酸菌數分別增加了1.30、1.10（lg（CFU/mL））；微生物可能充分利用了體系中的葡萄糖（碳源）和發酵產生的肽或氨基酸（氮源）進入對數生長期。12～36 h時，MP組中菌落總數和乳酸菌數維持穩定，而SP組中菌落總數和乳酸菌數持續上升，24 h時達到9.08（lg（CFU/mL）），之后急劇下降；這可能是發酵體系中的pH值接近MP的等電點（pH 5.0～5.2），使其發生了較大程度的聚集，限制了酶對蛋白質的可及性，最終降低了體系中微生物可利用的氮源釋放；相比之下，SP結構較為松散，更容易被蛋白酶降解，可為微生物生長提供充足的氮源；發酵48 h后由于營養物質的消耗和不良代謝物的積累，MP組和SP組的微生物數量均出現下降趨勢，其中SP組下降趨勢較為明顯。值得注意的是，發酵0～24 h過程中SP的乳酸菌數在菌落總數中的占比相對較高，在此階段SP中的乳酸菌可以較大程度地抑制雜菌生長，并可能提高蛋白質的降解度。

3 蝦糜MP和SP在發酵過程中pH值和蛋白酶活力的變化

如圖3A所示，與未發酵時相比，經發酵后兩種蛋白的pH值均顯著下降（

P

＜0.05）。兩組蛋白pH值的變化趨勢基本一致，均為先下降后保持穩定；MP和SP的初始pH值分別為6.90和6.91，12 h時迅速下降至4.85和4.81，24 h時為4.65和4.70。pH值的降低通常與乳酸菌數及其代謝產生的有機酸有關，這與微生物數量的變化趨勢一致；蛋白質降解產生肽、氨基酸和氨等堿性物質，可能是導致發酵后期pH值上升的原因。

如圖3B所示，兩組樣品中蛋白酶活力呈現相同的變化趨勢，均為隨發酵時間的延長而升高。發酵前SP組和MP組的蛋白酶活力分別為3.29 U/mL和3.28 U/mL，12 h時顯著上升，分別為6.47 U/mL和6.23 U/mL（

P

＜0.05）；48 h時為11.28 U/mL和10.99 U/mL（

P

＜0.05）。除0、36 h外，發酵過程中SP組中的蛋白酶活力均顯著高于MP組（

P

＜0.05）。發酵過程中蛋白酶的活力通常與微生物數量呈正相關，與pH值呈負相關，這與本實驗結果一致。

4 SDS-PAGE分析

如圖4所示，SDS-PAGE顯示了發酵期間兩組蛋白的降解情況，MP和SP均出現了不同程度的降解。發酵12 h時，MP的肌球蛋白重鏈（200～220 kDa）、肌動蛋白（45 kDa）、肌球蛋白輕鏈（21 kDa）均呈現出明顯的降解趨勢；24 h降解程度進一步加劇，在100、60 kDa左右處出現了新的條帶，小分子質量（＜15 kDa）條帶灰度進一步加深（圖4A），可能歸因于低分子質量的肽和游離氨基酸的產生。如圖4B所示，與MP相比，SP降解速度更快、程度更加明顯；發酵12 h時，200、130 kDa處的蛋白條帶強度出現顯著降低，60、45 kDa左右的蛋白條帶完全消失，70～90、26～34 kDa處及小分子質量（＜17 kDa）蛋白條帶灰度明顯增強；發酵36 h時甘油醛脫氫酶（34 kDa）蛋白條帶消失；發酵48 h時肌酸激酶-M型（42 kDa）條帶幾乎消失。以上結果表明，在接種乳酸腸球菌的發酵體系中，SP更容易發生降解，這可能是因為其具有相對松散的結構，更容易被蛋白酶識別和降解；蛋白質的降解除了與內源酶活性有關，還可能受到乳酸菌數量與代謝的影響，在本研究中表現為SP組中乳酸菌占比更大；此外，Nie Xiaohua等將乳酸菌接種到香腸中，同樣發現蛋白發生了較大程度的降解。

5 蝦糜MP和SP在發酵過程中DH和肽質量濃度的變化

如圖5A所示，隨著發酵時間的延長，SP組的DH呈現持續上升的趨勢，而MP組的DH無顯著變化（

P

＞0.05）；在發酵48 h過程中SP組的DH始終顯著高于MP組（

P

＜0.05）；0 h時SP組的DH顯著高于MP組（

P

＜0.05），說明在初始階段SP中就可能含有更多的α氨基酸或小分子肽；48 h時SP和MP組的DH分別是0 h的1.21 倍和1.10 倍，表明SP組的最終DH增長程度顯著高于MP組，此結果與SDS-PAGE結果（圖4）相印證。如圖5B所示，兩種蛋白中肽質量濃度的變化均呈現先下降后上升的趨勢；0～48 h，SP組的肽質量濃度顯著高于MP（

P

＜0.05），與DH測定結果相似；12 h時兩組肽質量濃度均顯著下降（

P

＜0.05），而12 h后緩慢上升。

在發酵過程中，對蛋白質起降解作用的酶有內源性蛋白酶和微生物酶；內源性蛋白酶在發酵初期起主導作用，可將初始蛋白或肽轉化為氨基酸、酮酸、醛等化合物，導致肽質量濃度降低；微生物酶如由乳酸菌產生的胞外蛋白酶（氨肽酶、二肽酶、三肽酶等）則在發酵后期起主導作用，可將蛋白質或肽進一步降解為氨基酸或更小的肽，其中分子質量小于3 kDa的肽具有更高的抗氧化能力。發酵初期，體系內的氨基酸作為氮源供給微生物的生長（圖2），這可能是12 h時MP水解度下降的原因，而SP水解度未下降可能歸因于其起始階段較高的肽含量，使得氨基酸的生成量與消耗量相當。

6 蝦糜MP和SP的抗氧化活性分析

體外抗氧化實驗是評價物質抗氧化活性的常用方法，根據氧化方式不同可分為自由基清除能力測定（如ABTS陽離子自由基、DPPH自由基、羥自由基等）和還原能力測定等。本研究采用ABTS陽離子自由基、DPPH自由基、羥自由基清除能力和Fe3+還原能力實驗綜合評價了兩組蛋白發酵體系中肽的抗氧化能力。

ABTS陽離子自由基清除率可以反映體系內包括親水性和疏水性肽在內的總抗氧化活性。如圖6A所示，SP組和MP組的ABTS陽離子自由基清除能力均隨發酵時間的延長而增加，且SP組顯著高于MP組（

P

＜0.05）；發酵48 h時MP和SP組的ABTS陽離子自由基清除率分別為47.11%和80.05%，顯著高于未發酵的MP和SP（

P

＜0.05）。結果表明，通過乳酸菌發酵可以顯著提高兩種蛋白體系的抗氧化能力，而SP組具有較高的降解度、可溶性肽或氨基酸含量，可能是其具有較高抗氧化活性的主要原因。

DPPH自由基清除能力主要反映疏水性物質的抗氧化特性。如圖6B所示，兩種蛋白肽的DPPH自由基清除能力及變化趨勢不同，MP組先上升后下降，而SP組呈現持續上升的趨勢；發酵結束時兩組DPPH自由基清除率均顯著高于未發酵時的蛋白（

P

＜0.05）。在0～24 h內，MP組的DPPH自由基清除率高于SP組，其中12 h時MP組顯著高于SP組（

P

＜0.05），可能是由于在此發酵階段MP降解產生了更多的疏水性抗氧化肽，這可能與MP的一級結構直接相關，或與體系內蛋白酶的催化特異性相關。綜合ABTS陽離子自由基清除率分析結果，SP組中可能含有更多的親水性抗氧化肽；24 h后MP組的DPPH自由基清除率降低，SP組則持續上升，36 h時SP組的DPPH自由基清除率顯著高于MP組（

P

＜0.05）。發酵后期MP組抗氧化活性降低的原因可能是抗氧化肽在蛋白酶的作用下持續降解。

如圖6C所示，SP組的羥自由基清除率呈現下降趨勢，而MP組無顯著變化，這表明通過乳酸菌發酵兩種蛋白均不能得到具有高羥自由基清除能力的肽。如圖6D所示，兩組蛋白發酵后肽的Fe3+還原能力均顯著增加（

P

＜0.05），且SP組的還原能力更強；48 h時MP和SP組的Fe3+還原能力分別為87.60%和92.11%。

值得注意的是，SP組在肽質量濃度下降的過程中抗氧化活性仍呈現上升趨勢；推測決定肽抗氧化能力的因素除了肽質量濃度，其氨基酸序列和末端結構可能是影響其抗氧化能力的另一重要因素；有些氨基酸如酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸，可以通過直接或間接與自由基發生反應而起到抗氧化作用；此外，如果肽的N末端和C末端存在特定的化學官能團，如羥基、硫醇基、羧基等，它們也可以通過與自由基發生反應或提供電子給自由基，從而發揮抗氧化作用。

7 相關性分析

分別對MP和SP發酵體系中的微生物數量、蛋白酶活力、pH值、DH、抗氧化能力進行相關性分析，結果如圖7所示。MP和SP組的菌落總數和乳酸菌數呈顯著正相關（

P

＜0.01、

P

＜0.001），可以推測乳酸菌是發酵體系中的主要微生物；菌落總數、乳酸菌數與pH值呈顯著負相關（

P

＜0.05、

P

＜0.01、

P

＜0.000 1），表明細菌尤其是乳酸菌的生長和代謝可能是導致體系pH值下降的主要原因；在發酵體系中，尤其是SP組的蛋白酶活力與DH、ABTS陽離子自由基清除率、DPPH自由基清除率以及Fe3+還原能力呈顯著正相關（

P

＜0.05、

P

＜0.01），由蛋白酶活力升高導致的蛋白質降解可能是提高抗氧化能力的關鍵因素；除SP組的肽質量濃度和羥自由基清除率外，pH值與蛋白酶活力、其他的抗氧化能力呈負相關，表明pH值的降低在一定程度上可以提高酶活力和抗氧化能力。綜上所述，乳酸菌可能通過提高菌落總數、酶活力和降低pH值從而提高蛋白發酵體系的肽含量及其抗氧化能力。

結論

本實驗探究了蝦肉蛋白在發酵過程中水解和抗氧化活性的變化規律。結果表明，接種乳酸腸球菌S15可以通過增加發酵體系中菌落總數、降低pH值和提高蛋白酶活力等方式促進MP和SP的降解、提高肽的生成及抗氧化性能；未發酵的SP體系中含有更多的抗氧化物質，發酵使其變化更為明顯。本研究可以為水產蛋白尤其是SP的充分利用和抗氧化肽的開發提供參考。

作者簡介

1

第一作者

熊治渝 實驗師/碩導

熊治渝，博士，實驗師，江蘇大學碩士生導師，中國食品科學技術學會會員。主要從事水產品加工與營養健康、水產品發酵與風味品質變化等方面的研究。主持或參與市廳級以上項目7 項，發表學術論文20余篇。

2

通信作者

袁麗 教授/博導

袁麗，教授，江蘇大學博士生、碩士生導師。長期從事食品化學與營養、水產品加工及貯藏等方向的基礎和應用研究。主持或參與國家自然科學基金、國家重點研發等項目10余項；獲省部級獎勵2項；授權國家發明專利10余件；發表學術論文50余篇。

本文《蝦肉蛋白在乳酸菌發酵過程中的降解及其體外抗氧化活性的動態變化》來源于《食品科學》2024年45卷第22期 65-72頁，作者：熊治渝，孫蘭靜，張倩倩，高瑞昌，袁 麗*。 DOI:10.7506/spkx1002-6630-20240418-178. http://www.spkx.net.cn點擊下方閱讀原文即可查看文章相關信息。

實習編輯：申婧婧 ；責任編輯：張睿梅。點擊下方閱讀原文即可查看全文。圖片來源于文章原文及攝圖網。

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