【寫在前面】：本期推薦的是由陸軍軍醫大學大坪醫院研究團隊近期發表于Journal of Ethnopharmacology(IF=4.8）的一篇文章，揭示整合代謝組學與網絡藥理學探究香芍散結口服液治療大鼠乳腺增生的作用機制。

【期刊簡介】

【題目及作者信息】

Integrating metabolomics and network pharmacology to explore the mechanism of Xiangshao Sanjie Oral Liquid in treating rats with mammary gland hyperplasia

民族藥理學相關性：香芍散結口服液（XSSJ）是一種傳統中藥方劑，臨床上用于治療乳腺增生（MGH），但其作用機制尚不明確。

研究目的：本研究旨在通過血漿代謝組學和網絡藥理學的綜合策略，探討XSSJ對MGH的治療機制。

材料與方法：建立MGH大鼠模型，并采用多項指標進行療效評估。隨后，通過代謝組學策略尋找可能在誘導MGH中起重要作用的血漿代謝物和代謝途徑。此外，采用超高效液相色譜-串聯四級桿飛行時間質譜（UPLC-Q-TOF-MS）和網絡藥理學分析，鑒定XSSJ在大鼠血漿中的原型化合物及可能起效的靶基因。最后，通過實時定量聚合酶鏈反應（RT-qPCR）和西方印跡法（Western Blot，WB）對結果進行整合和驗證。

結果：XSSJ對MGH具有治療作用。通過代謝組學研究，鑒定了XSSJ在治療MGH過程中的29種差異代謝物。給予XSSJ后，在大鼠血漿中發現了16種原型化合物，這些化合物與179個潛在治療靶點相關。綜合分析表明，XSSJ可逆轉MGH大鼠中EGFR、ESR1、AKT1、SRC和PTPN11的mRNA表達。此外，不同劑量的XSSJ抑制了p-PI3K和p-AKT蛋白的表達。

結論：本研究結合代謝組學和網絡藥理學，揭示了XSSJ通過PI3K/AKT通路對MGH的調控作用，為進一步支持XSSJ的臨床應用提供了依據。

（圖文摘要）

【結果】

1. XSSJ對MGH模型的藥效學結果

為評估XSSJ對MGH的影響，我們全面檢查了幾個關鍵參數，包括測量乳頭直徑和乳頭高度的變化，以及分析子宮指數和血清性激素水平。與NC組相比，MGH模型中乳頭直徑（圖_2B，p<0.01）、乳頭高度（圖_2C，p<0.01）和子宮指數（圖_2D，p<0.05）均顯著增加。相反，在用不同劑量的XSSJ治療后，乳頭高度、乳頭直徑和子宮指數呈劑量依賴性降低，接近NC組。

蘇木精-伊紅染色結果顯示，NC組乳腺組織無異常增生，腺泡數量極少，幾乎無擴張，乳腺導管和管腔無分泌物（圖_2E）。MGH組乳腺組織顯著增生，乳腺小葉體積增大，腺泡數量增加，接近融合，腺泡和管腔擴張且分泌過多（圖_2E）。然而，經XSSJ治療后，MGH癥狀顯著改善，乳腺小葉體積、腺泡數量和管腔分泌均顯著減少。同時，MGH組血清中的雌二醇、孕酮和催乳素水平顯著升高（圖_2F、G、H，p<0.01，MGH與NC組相比）。經不同劑量的XSSJ治療后，血清中的雌二醇、孕酮和催乳素水平顯著改善。

2. 代謝組學分析

通過使用QC樣品確認了分析方法和儀器的穩定性和重現性。無監督PCA結果顯示，所有QC樣品在評分圖上均在±2 STD范圍內（圖_3A、B），表明整個分析過程中儀器穩定性良好。

從代謝組學數據得出的主成分分析（PCA）圖顯示，MGH組與NC組之間有明顯分離（圖_3C、D）。這種清晰的分界表明MGH模型已成功建立，支持了實驗設計的有效性和兩組之間代謝譜的差異。此外，XSSJ-H組的位點與NC組有一定程度的重疊，表明兩組之間有顯著的空間關系。這種接近性與生物化學和組織學分析的結果一致，進一步證實了觀察到的效果的有效性。這些結果表明，XSSJ-H組對MGH大鼠的代謝紊亂有積極影響，突出其潛在的治療價值。

采用監督正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）模型來識別正常對照（NC）組與乳腺增生組（MGH）之間的代謝變化，以及MGH組與XSSJ-H治療組之間的代謝變化。為評估模型性能，使用了參數R2Y和Q2。R2Y表示模型的擬合優度，揭示模型對數據中變異的解釋程度；Q2評估模型的預測能力，反映其將發現推廣到獨立數據集的能力。結果顯示，R2Y和Q2的值接近1，表明OPLS-DA模型擬合適當，在代謝組學變量評估中具有強大的預測能力（圖_4）。同時，進行了200次置換檢驗以評估OPLS-DA模型的穩健性。分析顯示，所有計算出的Q2斜率均低于零，表明OPLS-DA模型沒有過擬合，如圖_4A2、B2、C2、D2所示，這證實了模型的可靠性和有效性。

3.3. 差異代謝物的篩選與鑒定

在代謝組學分析中，根據VIP>1和P<0.05的參數，我們篩選了NC組與MGH組之間以及XSSJ-H組與MGH組之間的差異代謝物。在NC組和MGH組之間共鑒定出67種差異代謝物。然而，XSSJ治療部分逆轉了雌激素和孕激素誘導的乳腺增生的代謝變化，消除了MGH大鼠的29種代謝變化，其中11種代謝物下調，18種上調。因此，這29種差異代謝物被確定為與MGH治療相關的關鍵生物標志物。各組間生物標志物的趨勢如補充表2所示。此外，我們制作了熱圖，以展示不同組間潛在生物標志物相對豐度的差異，如圖_5A所示。分析顯示，NC組和MGH組在顏色表示上有顯著區別，而XSSJ-H組的顏色模式與NC組非常相似。這表明，XSSJ-H治療有效逆轉了這些代謝物的變化，突顯了干預措施的有效性。

4.我們使用MetaboAnalyst 6.0研究與XSSJ治療MGH相關的差異代謝物所調控的代謝途徑。在影響值>0.01的參數下，共富集到10條代謝途徑，其中6條被認定為關鍵代謝途徑（圖_5B和補充表3），包括亞油酸代謝、α-亞麻酸代謝、戊糖和葡萄糖醛酸相互轉化、初級膽汁酸生物合成、脂肪酸生物合成、類固醇激素生物合成（圖_5B和補充表3）。

5. XSSJ在血漿中的原型分析

通過文獻回顧、內部數據庫、參考標準品和匹配MS/MS碎片規則，初步鑒定了XSSJ的原型化合物。通過UPLC-Q-TOF-MS在XSSJ中檢測到88種化合物，這些化合物在以往研究中已有涉及。其中，有16種原型化合物通過UPLC-Q-TOF-MS被明確鑒定出來。結果列于表2中，而大鼠血漿樣本在給予XSSJ后的總離子色譜圖如圖_6所示。

6. 網絡藥理學分析結果

6.1. 原型成分及MGH的治療靶點獲取

給予XSSJ后，在血漿中鑒定出16種原型化合物，并通過網絡藥理學進行分析。將這些原型化合物上傳至TCMSP、HERB和Swiss Target Prediction數據庫，共鑒定出468個與原型化合物相關的靶點。為了確定與疾病相關的靶點，以“乳腺增生”為關鍵詞進行搜索，從GeneCards和OMIM等權威數據庫中提取了3695個與乳腺增生相關的靶點。通過維恩圖分析，發現原型化合物靶點與乳腺增生靶點之間有179個共同靶點，這些靶點被認為是XSSJ治療MGH的潛在治療靶點（圖_7A）。

6.2. 化合物-靶點-疾病網絡構建

通過Cytoscape軟件3.7.2構建了16種原型化合物、179個潛在治療靶點和MGH之間的C-T-D網絡。如圖_7B所示，該網絡包含196個節點（16個化合物節點、1個疾病節點和179個靶點節點）和1109條邊。黃色菱形代表原型化合物，藍色橢圓代表XSSJ在MGH治療中的潛在治療靶點，紅色八邊形代表MGH。節點的度值（即其連接數）反映了節點的重要性。其中，木犀草素的度值為40，在所研究的化合物中最高（補充表4），這表明木犀草素是治療MGH的主要活性成分，與之前關于木犀草素在乳腺癌治療中關鍵作用的研究一致。

6.3. 蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡構建

將179個潛在治療靶點整合到STRING數據庫中，構建了蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡。去除未與網絡連接的節點后，PPI網絡由158個不同節點和617條連接邊組成（圖_7C）。然后使用CytoHubba插件篩選出中心基因（圖_7D）。確定的十個主要基因為表皮生長因子受體（EGFR）、磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶催化亞基α（PIK3CA）、蛋白激酶B（AKT1）、SRC原癌基因（SRC）、蛋白酪氨酸磷酸酶非受體型11（PTPN11）、磷脂酰肌醇-3-激酶調節亞基1（PIK3R1）、信號轉導和轉錄激活因子3（STAT3）、磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶催化亞基δ（PIK3CD）、雌激素受體1（ESR1）和磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶催化亞基β（PIK3CB），這些基因被認為是XSSJ在MGH治療中的中心基因。

6.4. GO和KEGG富集分析

使用DAVID 6.8數據庫，通過FunRich軟件對潛在靶點進行GO富集分析。圖_7E-G顯示了在細胞組分（CC）、生物過程（BP）和分子功能（MF）中排名前十的富集項。細胞組分主要包括血漿膜、細胞質、細胞核等；生物過程包括磷酸化、信號轉導等；分子功能包括蛋白質結合、ATP結合等。KEGG富集分析排名前20的通路如圖_7H所示，主要涉及PI3K-AKT信號通路等，其中PI3K-AKT信號通路是最顯著富集的。值得注意的是，類固醇激素生物合成等通路也顯著富集，與血漿代謝組學分析結果部分一致。

7. 構建化合物-靶點-代謝物網絡并篩選關鍵靶點

為深入了解XSSJ在MGH治療中的作用，通過代謝組學和網絡藥理學的協同分析，構建了化合物-靶點-代謝物（C-T-M）網絡。在基因-代謝物關系分析中，將29種差異代謝物和179個潛在治療靶點輸入MetaboAnalyst 6.0，篩選后去除7種代謝物和82個無連接的潛在治療靶點，最終保留22種代謝物和97個關鍵靶點，并構建了基因-代謝物（GM）網絡（圖_8A）。隨后，將16種原型成分、97個關鍵靶點和22種代謝物整合到Cytoscape 3.7.2中，構建C-T-M網絡（圖_8B）。這些關鍵靶點與PPI網絡篩選出的前十中心基因相交集，紅色橢圓代表與中心基因重疊的關鍵靶點。因此，EGFR、ESR1、AKT1、SRC和PTPN11被確定為XSSJ治療MGH最相關的基因，并進一步驗證。

8. XSSJ對MGH中EGFR、ESR1、AKT1、SRC和PTPN11 mRNA表達的影響

通過RT-qPCR進一步檢測乳腺組織中EGFR、ESR1、AKT1、SRC和PTPN11的mRNA表達水平。如圖_9所示，與NC組相比，MGH組中這些基因的表達顯著增加，而XSSJ處理顯著逆轉了這些關鍵靶點的表達。這些結果表明，XSSJ可能通過調節EGFR、ESR1、AKT1、SRC和PTPN11來緩解MGH。

9. XSSJ對MGH中PI3K和AKT蛋白表達水平的影響

采用西方印跡法檢測PI3K和AKT蛋白的表達水平。如圖_10所示，與NC組相比，MGH組中p-PI3K和p-AKT蛋白水平顯著增加（P<0.01）。經XSSJ處理后，p-PI3K和p-AKT的表達水平顯著降低，表明XSSJ可能通過調節PI3K和AKT蛋白的表達來減輕MGH。

10. 分子對接驗證

采用分子對接Vina考察活性化合物與關鍵靶點的潛在相互作用。將EGFR、ESR1、AKT1、SRC和PTPN11五個關鍵靶點與活性化合物進行分子對接，這些靶點蛋白的結合能和結合類型如表3所示，對接結果如圖_11A所示。一般來說，配體-受體結合能越低，構象越穩定，通常將結合能為?5.0 kcal mol?1視為基準。以木犀草素和關鍵靶點為例，配體化合物與ESR1的氨基酸殘基W393和E353形成氫鍵（圖_11B），木犀草素在EGFR中形成兩個氫鍵，分別為K836和G833（圖_11C）。木犀草素和AKT1通過K268氫鍵相互作用（圖_11D），PTPN11和木犀草素結合到R362、W423、R465、G427、Q506和Q510的氫鍵網絡（圖_11E）。木犀草素和SRC通過K356氫鍵相互作用（圖_11F）。對接結果表明，XSSJ中的活性化合物對MGH的主要靶點具有較強的結合親和力。

乳腺增生（MGH）是一種常見的乳腺疾病，給眾多女性帶來身體和情感上的困擾。此外，長期MGH可能增加乳腺癌的風險。根據中醫理論，MGH的發生與激素失衡、肝郁、氣滯以及痰瘀血行問題密切相關。香芍散結口服液（XSSJ）具有平肝解郁、養血柔肝、活血化瘀、理氣止痛以及清熱散結的功效，與MGH的發病機制相契合。盡管XSSJ處方中的一些中藥已被證明對MGH具有臨床療效，但解釋XSSJ的作用機制仍是一個重大挑戰，這主要是由于MGH病因復雜，以及中藥治療涉及多種化合物、靶點和途徑。在本研究中，采用大鼠模型評估了XSSJ對MGH的影響。給予XSSJ和他莫昔芬后，多種生化和病理指標均顯著改善。這些藥效學結果為XSSJ治療MGH的應用提供了有力支持。

在中藥研究領域，口服給藥是一種非常常見的給藥途徑。眾所周知，只有進入血液循環的化合物才能發揮有效的藥理作用。為了篩選活性化合物，采用超高效液相色譜-串聯四級桿飛行時間質譜（UPLC-Q-TOF-MS）技術檢測XSSJ灌胃后大鼠血漿中吸收的原型化合物。最終成功鑒定了16種成分，包括木犀草素、甘草酸、橙皮苷、芍藥苷、丹參酸A、橙皮素等。雌激素和孕酮的失衡是乳腺增生發病機制的關鍵因素。現有研究表明，木犀草素能有效抑制雌激素合成過程，通過減少雌激素合成，可有效阻止雌激素依賴性細胞的異常增殖。橙皮素和橙皮苷能顯著影響雌激素信號通路中的基因表達，從而抑制乳腺癌細胞的增殖。甘草酸和甘草次酸具有抗雄激素和雌激素樣活性，很可能在乳腺增生的病理過程中發揮重要作用。此外，丹參酸A、木犀草素、芍藥苷、橙皮素和原阿片堿等化合物均可作用于PI3K/AKT信號通路。通過阻斷PI3K/AKT通路，它們能抑制細胞增殖并促進細胞凋亡，從而有效抑制乳腺增生。這些途徑和靶點與本文研究密切相關。盡管目前關于某些化合物在乳腺增生治療中的直接應用研究相對較少，且大多數研究集中在乳腺癌等相關領域，但這些化合物的作用機制研究成果仍為乳腺增生的治療提供了極具價值的參考。

代謝組學是研究細胞和生物體代謝產生小分子的學科，這些小分子反映了生物系統中復雜的生化反應結果。在MGH情況下，機體的代謝平衡可能改變，血漿代謝組學能夠捕捉到這些變化，為了解MGH的病理生理過程提供線索。過去的研究表明，影響MGH進展的重要生物標志物包括脂肪酸、氨基酸、膽汁酸、類固醇。在本研究中，共鑒定了29種差異代謝物，涉及多條代謝途徑。其中，初級膽汁酸生物合成和類固醇激素生物合成是XSSJ作用于MGH的關鍵代謝途徑。眾所周知，膽汁酸與膽固醇的合成、吸收和代謝密切相關。膽固醇作為雄激素合成的前體，間接調節雌激素的產生，從而對乳腺組織的各種生理和病理功能產生重大影響。通常，雌二醇水平升高常伴有膽汁酸水平升高。膽汁酸水平升高可直接促進法尼醇X受體的表達，同時抑制雌激素硫酸轉移酶的轉錄，最終導致雌二醇水平進一步升高，加重MGH程度。另一方面，在乳腺增生的發病機制中，膽汁酸代謝與PI3K/AKT信號通路之間的聯系不容忽視。許多研究文獻報道，各種膽汁酸能夠激活PI3K/AKT通路。在本研究中，我們關注初級膽汁酸生物合成，發現MGH大鼠中膽酸和甘氨膽酸水平顯著升高。根據Jiang等人和Mott等人的研究成果，膽酸和甘氨膽酸能夠激活PI3K/AKT信號通路，導致細胞異常增殖。值得注意的是，在本研究中，MGH大鼠的激素水平以及相關雌激素受體（ESR）及其下游PI3K/AKT基因的表達顯著升高。然而，經XSSJ治療后，這些指標顯著下降。這一結果進一步強調了代謝組學在MGH中富集途徑的重要性。

然而，僅用代謝組學來解釋復雜的疾病機制和藥物作用機制相對困難，因為代謝變化可能是多種因素共同作用的結果，難以識別特定的靶點和信號通路。因此，需要結合網絡藥理學技術。

網絡藥理學領域為中藥研究提供了新的視角和方法。利用基于網絡藥理學的系統視角，從分子水平上闡明了XSSJ治療MGH的機制。通過代謝組學治療調控，可以進一步利用網絡藥理學識別關鍵治療靶點。代謝組學和網絡藥理學的結合可以將差異代謝物的靶點與藥物靶點聯系起來，揭示疾病的干預機制。在本研究中，代謝組學結合網絡藥理學分析表明，表皮生長因子受體（EGFR）、雌激素受體1（ESR1）、蛋白激酶B（AKT1）、SRC原癌基因（SRC）和蛋白酪氨酸磷酸酶非受體型11（PTPN11）是XSSJ治療MGH的關鍵靶點。

EGFR主要參與細胞的生長、增殖和分化。根據Lu等人的研究，激素水平的變化可能激活其表達，進而激活PI3K-AKT信號通路，導致細胞增殖。ESR1與激素有直接且密切的關系，是雌激素的主要受體之一。雌激素通過與ESR1結合，觸發多種信號轉導途徑，影響細胞生長、分化和凋亡等生理功能。例如，在乳腺組織中，雌激素與ESR1結合后可促進乳腺細胞的增殖，這與MGH和乳腺癌的發生發展密切相關。ESR1位于PI3K-AKT信號通路的上游，可通過SRC基因傳遞，從而激活PI3K-AKT信號通路。PTPN11可能通過調節相關蛋白的磷酸化狀態影響激素信號的傳遞，但這種關系并非直接的激素效應。另一方面，PTPN11存在于細胞中，可直接作用于PI3K，通過去磷酸化影響PI3K-AKT通路，導致MGH。SRC在許多細胞信號過程中發揮作用，激素可能通過影響其他信號通路間接影響SRC的活性。已有研究表明，雌激素可能通過激活某些信號通路影響SRC的磷酸化狀態和活性，參與腫瘤細胞生長和轉移等過程。此外，針對SRC激酶的抑制劑ZD6474能夠抑制MCF-7乳腺癌細胞的生長，其機制可能是通過上調E-鈣黏蛋白表達、下調β-連環蛋白表達以及削弱Snail啟動子的轉錄活性，從而抑制乳腺癌細胞的侵襲和轉移。SRC可直接結合并激活PI3K。在此過程中，SRC通過磷酸化PI3K的調節亞基增強其脂質激酶活性，促使其將磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）轉化為磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3）。PIP3作為第二信使，可招募并激活AKT1。AKT1（絲氨酸和蘇氨酸蛋白激酶AKT）在細胞內信號傳導中發揮重要作用，激素可通過激活上游信號分子調節AKT1的活性。AKT1在ErbB2誘導的乳腺腫瘤發生中起關鍵作用。AKT1缺乏會延緩腫瘤生長，減少肺轉移，并降低乳腺上皮腫瘤細胞的大小和增殖能力，同時影響細胞周期相關蛋白的表達以及細胞的遷移和極性。AKT1促進乳腺腫瘤細胞的增殖和葡萄糖代謝。綜上所述，這5個關鍵上游靶點在XSSJ對MGH的治療效果中發揮重要作用。

此外，根據KEGG富集分析結果，潛在靶點最顯著的富集通路是PI3K-AKT信號通路。5個關鍵靶點均與該通路相關。因此，采用西方印跡法檢測相關關鍵靶點（PI3K和AKT）的蛋白表達水平。如圖10所示，MGH組總PI3K和AKT蛋白表達水平不變，而p-PI3K和p-AKT蛋白表達水平較NC組升高。XSSJ處理顯著逆轉了雌二醇和孕酮聯合誘導的MGH中p-PI3K和p-AKT表達上調。

為深入探索XSSJ治療MGH的可能活性成分，將這些原型化合物與上述5個關鍵靶點進行對接。對接實驗結果表明，XSSJ血漿原型成分與MGH相關的關鍵靶點具有較強的結合親和力。這一發現意義重大，因為它突顯了這五個上游靶點在介導XSSJ對MGH治療效果中的重要性。它們的高親和力表明，XSSJ與這些靶點的相互作用可能是該藥物治療這種疾病療效的基礎。

【結論】

本研究采用整合代謝組學和網絡藥理學的方法，深入探究了XSSJ治療MGH的作用機制。通過綜合分析，確定了五個關鍵靶點和一條信號通路，即表皮生長因子受體（EGFR）、雌激素受體1（ESR1）、蛋白激酶B（AKT1）、SRC原癌基因（SRC）、蛋白酪氨酸磷酸酶非受體型11（PTPN11）以及磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）信號通路。這些發現有助于我們更好地理解XSSJ治療MGH的復雜分子機制，并為其臨床應用提供了準確可靠的依據。

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