潰瘍性結腸炎（UC）是一種全球性的頑固疾病。四神丸合痛瀉要方（SSP-TXYF）是一種中藥復方制劑，被廣泛用于治療潰瘍性結腸炎，但其制備較為復雜。本研究對 SSP-TXYF 的成分進行分析，以找到一種能治療 UC 的天然化合物，并驗證其療效和機理，旨在探索與 SSP-TXYF 具有相同療效的新天然化合物。

結果表明，當歸素（Ang）是四神丸合痛瀉要方（SSP-TXYF）的主要活性成分。結合還原二甲基標記和串聯正交蛋白水解-基于活性的蛋白質譜分析（rdTOP-ABPP）以及網絡藥理學，發現ERK1/2和HDAC1可能是結合蛋白。隨后證實 Ang 不僅能抑制脂多糖誘導的 IEC-6 炎癥，還能有效抑制 2,4,6- 三硝基苯磺酸誘導的體內 UC。增加丙酸鹽和丁酸鹽的濃度，激活 GPR43 和 GPR109A 受體，增加 ERK1/2 活性，促進 Sp1 磷酸化，從而競爭性抑制 HIF-1α 和 HDAC1 的結合，最終增加 HIF-1α 的乙酰化是 Ang 的分子信號轉導機制。

研究表明，Ang能改善大鼠UC癥狀，激活結腸上皮細胞的GPR/ERK/SP1/HDAC1/HIF-1α通路，修復受損的腸粘膜屏障（IMB）。Ang的關鍵藥效學機制與SSP-TXYF一致，初步認為Ang可作為一種治療UC的新型天然藥物。

一、SSP-TXYF 抗 UC 作用的 Q 標記預測分析

圖1 根據 Q 標記預測，Ang 是 SSP-TXYF 的主要活性成分

• 根據 Q 標記的測定結果預測了 SSP-TXYF 的潛在活性成分。主成分分析圖（PCA）顯示，同組樣品具有良好的聚集度，說明實驗數據可靠。為了消除大鼠內源性物質對含 SSP-TXYF 血清分析鑒定的影響，將大鼠對照血清作為陰性對照，最大程度地準確分析和鑒定 SSP-TXYF 在血清中的吸收情況。根據假設，模型大鼠體內含有的 24 種原型成分有可能成為 SSP-TXYF 藥理作用的關鍵活性成分。

• 根據定性分析結果和藥理研究報告，選擇了 12 種成分作為特征成分進行同步定量測定。對 SSP-TXYF 和含 SSP-TXYF 血清中的這 12 種代表性成分進行了定量分析，每組 3 個三重樣。與模型大鼠含 SSP-TXYF 的血清中的其他成分相比，柚皮苷（485,310 ng/mL）和當歸素（Ang）（2525 ng/mL）的含量相對較高。柚皮苷在 SSP-TXYF 中含量最高，但很容易水解，且沒有關于治療 UC 的報告，因此選擇 Ang 進行后續研究。
  

二 、通過網絡藥理學和基于 rdTOP-ABPP 的化學蛋白質組學鑒定 SSP-TXYF 靶標

圖2 根據網絡藥理學預測，HIF-1 信號通路是主要通路

而 HDAC1 是主要靶點

• 從 TCMSP 共鑒定出 663 種治療靶點衍生化合物，并使用 UniPort 數據庫調整了其基因名稱。從 GeneCards、OMIM 和 DrugBank 數據庫中收集了 2452 個 UC 相關靶點。通過維恩圖確定了 SSP-TXYF 靶點與 UC 靶點之間的 286 個重疊基因。為了識別具有直接或間接相互作用的靶標，將這 286 個重疊基因導入 STRING 數據庫并構建了 PPI 網絡。PPI 網絡由 284 個節點和 8599 條邊組成。根據其 DC、BC 和 CC 值確定了核心靶標。度值最高的蛋白質靶標是 HDAC1。將靶標分為兩組（，進一步研究 SSP-TXYF 在 UC 中的功能，對 286 個重疊靶標進行KEGG富集分析，發現 HIF-1 信號通路與 UC 的發生發展密切相關。
  

圖3 對 IEC-6 中與 SSP-TXYF 相互作用的蛋白質

進行 rdTOP-ABPP 分析

• 通過化學蛋白質組學鑒定 SSP-TXYF 的潛在傳感器。首先通過凝膠內熒光檢測了IA在IEC-6裂解液中的效率。將 IEC-6 裂解液與 100 μM 的 IA 培養 1 小時，同時加入陰性對照和聯合處理不同濃度 SSP-TXYF 的競爭樣本。SDS-PAGE分離探針標記的蛋白質，并用凝膠內熒光顯像。在體外實驗中，IA 被 SSP-TXYF 有效地競爭掉，表明它在 IEC-6 蛋白質組中有廣泛的蛋白質相互作用。

• 將 IA 探針與定量質譜分析相結合，鑒定了 IEC-6 蛋白質組中與 SSP-TXYF 相互作用的蛋白質。LC-MS/MS分析后用 CIMAGE對二甲基標記比率進行量化，從而得到每個已鑒定蛋白質-Rcomp 的比率。三個生物重復中進行了化學蛋白質組分析，只有滿足以下所有條件的蛋白質才會被指定為 SSP-TXYF 相互作用的靶標：(1) 它必須在所有三個重復中被量化；(2) 平均 Rcomp ≥ 1.5 且計算出的 p 值 < 0.05（圖 3D）。根據這些標準，共鑒定出 266 個與 SSP-TXYF 相互作用的蛋白質。對這 266 個靶標進行了 KEGG 分析，結合網絡藥理學和 rdTOP-ABPP 的結果，推測 SSP-TXYF 的結合靶點主要集中在位于 HIF-1 信號通路上的 ERK1、ERK2 和 HDAC1 蛋白上。
  

三、當歸素可改善 UC 模型中的炎癥和 IMB 功能

圖4 Ang 可改善 TNBS 誘導的大鼠 UC 癥狀

• 大鼠灌腸注射2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS）誘導UC模型，Ang 每天灌胃一次，連續八天。結果表明，Ang 對大鼠的體重和結腸長度有保護作用。疾病活動指數（DAI）評分顯示，Ang 能明顯改善 UC 大鼠的疾病癥狀。與正常大鼠相比，模型大鼠血清中的 IL-6、IL-1β 和 TNF-α 水平明顯升高。Ang劑量依賴性地降低了血清中IL-6、IL-1β和TNF-α的水平。

• 這些結果表明，Ang 對 TNBS 誘導的大鼠 UC 有明顯的保護作用。
  

圖5 Ang 可增強 IMB 的功能

• 評估大鼠的病理狀況、杯狀細胞數量和 IMB 相關蛋白指數。模型組表現出嚴重的損傷，包括隱窩變形、固有膜和粘膜下層炎性細胞浸潤以及杯狀細胞脫落，這些損傷在 Ang 治療組明顯減輕。在脂多糖（LPS）誘導的 UC 大鼠和 IEC-6 模型中，Ang 能顯著增加 IMB 相關蛋白指數，包括 zonula occludens-1 (ZO-1)、Mucin-2 (MUC2)、occludin 和 claudin-1。這些發現表明，Ang 的預防作用與修復受損的 IMB 無關。
  

四、當歸素通過抑制 HDAC1 的活性調節 HIF-1α 乙酰化

圖6 血管緊張素通過抑制 HDAC1 增加 IEC 中 HIF-1α 乙酰化的表達

• CETSA-WB結果顯示，與DMSO組相比，當Ang與HDAC1結合時，IEC-6細胞的熱穩定性增加。WB結果顯示，與模型大鼠相比，Ang處理大鼠的HDAC1水平明顯受到抑制。這些結果證實 Ang 調節 HDAC1 的表達。

• 進一步探討 Ang 對 HIF-1α 的影響，HDAC1 是一類蛋白去乙酰化酶，能調節 HIF-1α 乙酰化/去乙酰化的平衡，因此研究 Ang 是否能調節 HIF-1α 的乙酰化表達。與 UC 組相比，Ang 處理能顯著增強 HIF-1α 乙酰化。共免疫沉淀（Co-IP）觀察到 Ang 抑制了 HDAC1 和 HIF-1α 之間的直接相互作用。腹腔注射特異性 HDAC1 激動劑 ITSA-1 后，Ang 不能調節 HIF-1α 的乙酰化水平，也不能影響 HIF-1α 與 HDAC1 的相互作用。這些數據表明，Ang 抑制了 HDAC1 的表達，從而使 HIF-1α 乙酰化/去乙酰化的平衡向乙酰化傾斜。
  

五、當歸素調節 HIF-1α 乙酰化以保護 IMB

圖7 激活 HDAC1 可逆轉 Ang 介導的對 IMB 損傷的改善作用

• 使用 ITSA-1 激活了 HDAC1 的表達，并檢測了 IMB 相關指標。ITSA-1 激活 HDAC1 會抵消 Ang 對 UC 大鼠的保護作用，包括體重、DAI 評分、結腸長度和炎癥因子。ITSA-1 的激活逆轉了 Ang 介導的 IMB 損傷改善效應，包括結腸病理狀態、杯狀細胞數量和 IMB 相關蛋白。這些發現表明，Ang 可抑制 HDAC1，進而調節 HIF-1α 乙酰化，達到保護 IMB 的目的。
  

六、當歸素通過激活 ERK/Sp1 信號通路介導對 HDAC1 表達的抑制

圖8 血管緊張素通過激活 ERK/Sp1 信號通路抑制 HDAC1 的表達

• 使用CETSA-WB和分子對接來探討ERK1/2與Ang的結合能力。細胞CETSA-WB結果顯示，與DMSO組相比，當Ang與ERK1/2結合時，IEC-6細胞的熱穩定性增加。IEC-6和HT-29細胞的免疫熒光實驗和UC大鼠的WB實驗結果顯示，與模型組相比，Ang處理后ERK1/2的水平顯著升高。這些結果證實ERK1/2是Ang的靶點。

• 推測Ang 是通過激活 ERK/Sp1 信號通路來抑制 HDAC1 的表達，結果發現 Ang 確實能顯著提高 Sp1 的磷酸化水平。通過檢測 IEC-6 細胞核和細胞質中的蛋白含量，發現 Ang 主要提高了細胞質中 ERK1/2 的水平和細胞核中 Sp1 的磷酸化水平。為了探討ERK1/2在Ang處理后調控HDAC1表達中的作用，用ASN007苯磺酸鹽抑制ERK1/2的轉錄活性，并檢測了磷酸化Sp1和HDAC1在IEC-6中的表達。結果表明，在 LPS 誘導的 IEC-6 中，ASN007 苯磺酸鹽抑制了磷酸化-Sp1 的蛋白水平，同時增加了 HDAC1 的水平，這表明 ERK/Sp1 在 Ang 控制 HDAC1 表達的過程中發揮了作用。
  

七、當歸素介導丙酸和丁酸調節ERK/Sp1信號傳導

圖9 血管緊張素通過丙酸鹽和丁酸鹽介導 GPR 受體進入 IEC，從而調節 ERK/Sp1 通路

• 在胃腸道內，結腸上皮細胞會優先吸收短鏈脂肪酸（SCFA）作為能量來源，從而促進上皮細胞增殖并幫助損傷修復，因此對結腸中的 SCFAs 數量進行了量化。通過 PCA，觀察到 SCFAs 在對照組、模型組和 Ang 組之間有明顯的聚類。與 UC 組相比，Ang 組丙酸鹽和丁酸鹽的相對豐度顯著增加。這些結果表明，在 UC 模型中丙酸鹽和丁酸鹽的產生受到干擾，而 Ang 逆轉了這些變化。
  

• 假設 Ang 通過激活 GPR43/GPR109A 介導丙酸鹽和丁酸鹽調節 ERK/Sp1，實驗結果證實 Ang 會增加 UC 大鼠結腸、LPS 誘導的 IEC-6 和 HT-29 中 GPR43 和 GPR109A 的水平。為了研究 G 蛋白偶聯受體在 Ang 誘導的 ERK1/2（調控 HIF-1α 乙酰化的上游蛋白）增加中的作用，用 GPR43 拮抗劑 GLPG0974 或 GPR109A 拮抗劑 Mepenzolate bromide 處理了 LPS 誘導的 IEC-6 12 小時。發現抑制 GPR43 或 GPR109A 可減輕 Ang 誘導的 ERK1/2 在 IEC-6 中的積累，還能阻止 Ang 誘導的 IEC-6 中 Sp1 的磷酸化表達。這些數據共同證明，GPR43 或 GPR109A 在 Ang 促進 ERK 誘導磷酸化 Sp1 的過程中發揮了重要作用。
  

研究結論

結合 Q 標記和 rdTOP-ABPP 策略，研究發現Ang 對 HIF-1 信號通路中 HDAC1 和 ERK1/2 蛋白的影響是 SSP-TXYF 治療 UC 的重要機制。研究結果表明，Ang 可以緩解 UC 的癥狀，且Ang的效果與臨床上經典的抗UC藥物SASP的治療效果相當。 Ang 抗 UC 作用的基本機制之一是修復受損的 IMB，通過增加丙酸鹽和丁酸鹽的濃度，激活GPR43和GPR109A受體，提高ERK1/2的活性，促進Sp1磷酸化，從而競爭性抑制HIF-1α和HDAC1的結合，最終增加HIF-1α的乙酰化。該研究表明，Ang有可能發展成為一種潛在的抗UC天然藥物。

圖10 研究概要示意圖

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