2025年4月22日，耶魯大學張凱團隊在Nature Structural & Molecular Biology期刊發表最新研究成果：“The Mechanochemical Cycle of Reactive Full-length Human Dynein-1”，通過冷凍電鏡（cryo-EM）解析了處于反應態全長人源動力蛋白-1（dynein-1）馬達域（motor domain）在ATP水解以及微管結合/脫離過程中的多個關鍵中間態，描繪了其迄今最完整的高分辨動態構象全景圖。該研究不僅填補了動力蛋白研究中長期缺失的結構環節，更為揭示細胞內動力蛋白如何將ATP的化學能高效轉化為方向性機械力的機制提供了核心線索。

Dynein是細胞內最關鍵的分子運輸機器之一，主導幾乎所有沿微管負向運輸的細胞內活動。它介導多種細胞器和胞內貨物的定位與動態調控，包括線粒體、內質網、溶酶體、高爾基體、自噬小體、RNA-蛋白復合物（RNPs）、蛋白聚集體、各類囊泡、細胞核、甚至細胞骨架成分等。由于這些過程非常基本，所以dynein介導的微管負向運輸對人體生命活動至關重要，包括但不僅限于神經和運動系統發育、免疫細胞功能極化、變性和聚集蛋白質的清除、精子形成、纖毛和鞭毛運動、以及胚胎發育中的細胞遷移和極性建立等，其功能障礙已被明確關聯于多種神經退行性疾病、遺傳性發育障礙和免疫缺陷綜合征。除了細胞本身的天然貨物，dynein同樣在多種病毒（包括但不僅限于冠狀病毒、HIV、狂犬病毒、皰疹病毒、腺病毒等）及其他病原體在宿主細胞中的定位與復制過程中發揮重要作用。這些高度動態的基本生命活動，其核心驅動力來源于dynein結合并水解ATP所驅動的機械化學循環，深入理解該循環機制是揭開這些生命過程相關的一系列謎團的關鍵。

動力蛋白是所有馬達蛋白中結構最龐大、機制最復雜的一類，其重鏈的核心馬達結構域由一個包含六個不同AAA+結構域的環狀ATP酶馬達域（AAA+ ring）構成，輔以杠桿臂（linker）、微管結合域（MTBD）等多個功能模塊。在一個完整的ATP水解循環中，這些結構區域協同變化，實現“步態”轉換與力的輸出。

理解動力蛋白的工作機制的一個核心挑戰在于捕捉馬達域在ATP水解以及微管結合/脫離過程中的各種中間構象。基于這些中間構象，并結合生化實驗、單分子動力學等研究，研究人員潛在地可以構建出整個循環周期 (Schmidt and Carter 2016)。盡管過去已有多項關于馬達域的結構研究（包括晶體結構、單顆粒冷凍電鏡、冷凍斷層電鏡等），但是領域對動力蛋白工作機制的深入理解仍存在顯著局限和瓶頸，主要包括：

1）缺乏關鍵中間態結構。以往研究多采用截短體、ATP類似物或特定底物穩定特定構象，難以捕捉到馬達域在不同功能狀態下的連續構象變化。

2）缺乏結合微管時的高分辨結構。由于動力蛋白結合微管的非對稱性和低密度裝飾等特性，傳統解析微管結合蛋白的單顆粒冷凍電鏡流程難以適用。

為解決上述技術瓶頸，張凱團隊在單顆粒冷凍電鏡方法進行了新的探索和創新（見圖1）：

圖1：全長人源動力蛋白-1的冷凍電鏡結構分析。(a, b)冷凍電鏡實驗流程示意圖。(c) phi構象”動力蛋白冷凍電鏡圖，尾部分辨率為3.8–7.0 ?，馬達域達2.2 ?。(d) 開放構象動力蛋白馬達域在多種功能狀態下的代表性結構。(e) 結合微管的雙頭動力蛋白整體分辨率為10 ?，局部馬達域精修至2.9–3.6 ?。(f) 展示高分辨率結構細節。

1）針對關鍵中間態結構的缺失，團隊在樣品準備中使用全長動力蛋白，并在制樣過程中特意使用ATP處理，使馬達域處于動態的ATP水解循環中。相比之下，在傳統研究中這種處理則是大忌，因為這和結構生物學要求的穩定狀態的復合物這個理念剛好背道而馳。而本項工作中，研究團隊反其道而行之，特意收集高度活躍和柔性處于“工作狀態”下動力蛋白的冷凍電鏡數據，結合系統深入的三維分類，重建出多達10種主要功能狀態（不包括進一步的局部細分類）的馬達域高分辨結構（2.2 ? – 3.6 ?），包括多個此前未被報道的中間態。

2）針對微管結合狀態解析的難點，張凱團隊首先收集了動力蛋白與微管復合物的冷凍電鏡數據。為去除微管密集的周期性背景信號，研究團隊采用此前開發的“微管曲線擬合 + 信號剝離”方法(Chai, Rao and Zhang 2022)，成功消除微管信號干擾，從而實現了動力蛋白與微管結合狀態的高分辨重構。這一方法在2021年首次幫助團隊解析了外臂動力蛋白結合微管的高分辨結構(Rao, Han et al. 2021)（詳見BioArt報道：），并持續推動著動力蛋白結構研究領域的進展。在最新的研究中，團隊對dynein-1多種核苷酸結合狀態和微管結合狀態進行系統分析，最終獲取了40多個不同狀態的高分辨率全長人類dynein-1結構，從而構建出一個接近完整的dynein-1動態構象全景圖。

研究亮點有：

1）高分辨馬達域連續變化構象：通過大規模三維分類與重構，研究系統捕獲了ATP驅動下動力蛋白馬達結構域的一系列關鍵構象，完整覆蓋其ATP水解循環過程（圖2）。其中，分辨率最高的狀態高達2.2 ?，首次在動力蛋白中清晰觀察到活性位點水分子，直接證明該狀態為ATP水解后構象（含ADP、鎂離子及螯合水）。此外，研究還重建了活性口袋從“關閉”到“開放”的多個中間態，揭示AAA+環通過構象變化調控口袋開合，進而影響馬達對微管的親和力，為理解其力學-化學耦合機制提供關鍵線索。

圖2：未結合微管的動力蛋白馬達域在反應中的構象分布。(a)動力蛋白馬達域在催化循環中的八個主要狀態，分為自我抑制狀態（左）和活躍循環狀態（右）。(b, c) 2.2 ?分辨率下的AAA1活性口袋冷凍電鏡圖及氫鍵網絡。(d) 卡通模型展示AAA1從關閉到開放的動態變化。

2）揭示磷酸釋放“分子后門”機制：磷酸釋放過程高度動態，一直是動力蛋白機制研究中的技術難點。此次研究發現，在活性口袋“關閉”狀態下，杠桿臂（linker）竟可呈現出直立與彎曲兩種狀態——這一現象和此前的機制理解大相徑庭。深入分析表明，盡管活性位點封閉，靠近活性口袋末端的sensor-I loop區域卻顯示出多種不同構象，暗示磷酸可通過該“分子后門”路徑釋放（圖3）。此發現為理解磷酸如何從馬達內部釋放，并調節杠桿臂的構象提供了嶄新視角，為動力蛋白的完整機制模型填補關鍵一環。

圖3：磷酸釋放的分子后門機制。(a, b) sensor-I環在ATP條件下表現出構象異質性。(c, d) 比較閉合AAA1狀態下結合的核苷酸與sensor-I環的結構以及分子后門。

3）杠桿臂構象調控與步態機制偶聯：以往研究認為，杠桿臂由彎曲狀態轉為直立狀態是動力蛋白產生力的“動力沖程（powerstroke）”，該過程也與其結合微管相伴發生。然而，該模型無法解釋動力蛋白如何完成一步前進動作，因此“動力沖程”與“步態”之間的構象聯系長期缺失。本研究通過系統解析動力蛋白結合和脫離微管時的構象，發現杠桿臂在AAA+環上的多種構象，尤其識別出三個關鍵構象：pre（彎曲態）、post-1（直立態-1）和post-2（直立態-2）。進一步分析表明，post-2 構象與馬達在微管上的跨步過程高度相關。值得一提的是，研究團隊此前在外力臂調控中的結構研究中首次觀察到dynein的post-2狀態并提出其潛在和dynein的跨步相關，但該狀態的生理意義和具體的機制并不清楚。本次研究利用全長人源dynein-1，不僅重新觀察到了dynein-1同樣存在post-2狀態，并且還捕獲了大量的中間態構象，清楚回答了dynein-1在完成一個動力沖程之后更加偏好post-2這個狀態，從而揭示了dynein-1的linker構象變化如何驅動步態轉變，非常清晰地將“步態機制”與“動力沖程”機制在結構層面實現耦合 （圖4）。

圖4：微管促進ATP酶活性并驅動動力蛋白沿微管單向行走的機制。(a)不同核苷酸條件下微管結合的動力蛋白馬達域的高分辨率冷凍電鏡圖。(b, c) 動力蛋白機制化學循環加速的示意圖。(d, e) 動力蛋白沿微管單向行進的機制。

此外，本研究還繪制了迄今最完整的動力蛋白馬達域構象圖譜，為基于大規模結構數據的統計分析提供了堅實基礎。研究團隊系統提取了各關鍵中間態的結構特征，進一步揭示微管如何通過構象調控加速ATP水解，并解析AAA+環內其他AAA結構域在此過程中的協同作用機制。除結構解析外，來自科羅拉多州立大學Steven M. Markus課題組的Indigo C. Geohring還提供了關鍵的功能驗證實驗，印證了結構發現的生物學意義。

https://www.nature.com/articles/s41594-025-01543-3

參考文獻：

1. Chai, P., Q. Rao and K. Zhang (2022). "Multi-curve fitting and tubulin-lattice signal removal for structure determination of large microtubule-based motors." J Struct Biol214(4): 107897.

2. Rao, Q., L. Han, Y. Wang, P. Chai, Y. W. Kuo, R. Yang, F. Hu, Y. Yang, J. Howard and K. Zhang (2021). "Structures of outer-arm dynein array on microtubule doublet reveal a motor coordination mechanism." Nat Struct Mol Biol28(10): 799-810.

3. Schmidt, H. and A. P. Carter (2016). "Review: Structure and mechanism of the dynein motor ATPase." Biopolymers105(8): 557-567.

學術合作組織

（*排名不分先后）

戰略合作伙伴

（*排名不分先后）

（*排名不分先后）

轉載須知

【非原創文章】本文著作權歸文章作者所有，歡迎個人轉發分享，未經作者的允許禁止轉載，作者擁有所有法定權利，違者必究。

BioArt

Med

Plants

人才招聘

會議資訊

近期直播推薦