撰文 | 風

調節性T細胞（Regulatory T cell，Treg）是機體主要的負調節免疫細胞，在維持自身耐受和組織穩態方面發揮重要作用。自身免疫性疾病是自身耐受打破引起免疫系統攻擊正常組織或器官而引發的常見疾病，在臨床上表現為頑固性、難治性和復發性。因此，增強Treg功能或者穩定性是治療自身免疫性或炎癥性疾病的有效策略（詳見BioArt報道：；；）。然而，這一方法仍存在不少技術瓶頸和障礙，如Treg的制備、功能性和穩定性以及靶向遞送等（詳見BioArt報道：）。大規模CRISPR篩選技術的出現促進細胞功能和命運相關重要調節因子的鑒定。然而，目前CRISPR在Treg領域的研究多集中天然Treg（nTreg）（詳見BioArt報道：）【1,2】，而在誘導Treg（iTreg）中較少。

近日，日本大阪大學免疫學前沿研究中心Shimon Sakaguchi研究團隊在Nature上發表了文章題為Genome-wide CRISPR screen in human T cells reveals regulators of FOXP3的文章。該文章通過全基因組CRISPR篩選技術鑒定RBPJ是Treg重要的負調節因子，RBPJ缺失維持Treg的功能和穩定性，為Treg分化的分子機制和開發靶向Treg的治療方法提供新的理解和靶點。

為揭示影響FOXP3表達的可能調節因子，作者在人原代CD4 T細胞開發CRISPR篩選平臺，即將全基因組sgRNA文庫腺病毒轉染CD4 T細胞配合Cas9蛋白電轉后經Treg分化培養后行流式檢測和RNA測序。結果發現已知的調控因子如TGFBR1、SMAD3/4、UHRF1和FOXP3，以及新的調控因子如SMARCB1、MIDN 和SIK3。對于負調控因子的GO注釋發現NOTCH調節通路基因顯著富集，如RBPJ、HDAC3、GPS2、TBL1XR1和NCOR1/2。同時，作者使用單個基因敲除驗證部分正性和負性調控因子作用效果?？傊?，作者使用全基因組篩選強調了FOXP3分子調節的多樣性。隨后，為了非偏倚評估可能的FOXP3調節因子引起的整體轉錄組和選擇性蛋白改變，作者結合細胞內CITE-seq在單細胞層面通過胞內FOXP3定量驗證上述挑選的可能調節因子。令人振奮的是，作者發現靶向RBPJ、SIK3和ZBTB7B確實增加FOXP3蛋白的表達。接著，作者應用MIMOSCA框架模擬單個基因的遺傳擾動對轉錄組的影響，由此建立的調控模型將227個靶向敲除基因與2192個顯著改變的基因關聯起來，這些基因可以進一步聚類為11個協同功能靶基因模塊（模塊A-K）和10個基因共調控程序（GP1-10）。其中，GP3和10與T細胞反應有關；GP1與染色質調節有關；GP5與IL-2信號有關；GP6-8與細胞代謝有關。模塊K的擾動導致細胞代謝轉換為無氧糖酵解；模塊G引起效應T反應、細胞骨架重塑和IL-2信號。值得注意的是，作者發現針對RBPJ的擾動靶基因之間存在大量調控互作，表明其可能是iTreg的中心樞紐并受到多種信號的調節?？傊?，這些數據分析強調RBPJ作為一種新型FOXP3表達的負調節因子。

RBPJ是Notch信號通路的核心轉錄因子，通過與Notch受體胞內段（NICD）結合并招募輔激活因子（如MAML1）啟動靶基因轉錄【3】。另外，在缺少Notch信號時，RBPJ可與表觀修飾因子（如HDAC3）或轉錄抑制因子（如NCOR1/2）結合直接抑制基因表達【4】。然而，作者發現Notch信號改變不能引起FOXP3表達改變，排除了RBPJ參與經典Notch信號通路調節FOXP3表達。同時，nTreg細胞RBPJ敲除卻并不影響FOXP3表達，表明RBPJ的作用具有環境依賴性。為了排除分化效率引起的混雜因素，作者分選Treg后行RNA-seq直接比較RBPJ敲除引起的轉錄組變化，發現RBPJ敲除上調FOXP3、IL2RA、ENTPD1、ICOS、TIGIT、HAVCR2 和LRRC32，表明Treg核心特征增強。此外，體外實驗證實RBPJ敲除增強Treg的抑制功能和在炎癥環境中的穩定性。FOXP3的保守非編碼區（Conserved Non-coding Sequences，CNS）甲基化狀態影響其轉錄表達，在維持Treg功能和穩定性發揮重要作用【5】。作者發現RBPJ敲除明顯降低FOXP3的CNS2區域DNA甲基化?？傊?strong>RBPJ敲除促進了iTreg的分化、穩定性和功能。

RBPJ如何抑制FOXP3表達？作者使用151個針對RBPJ外顯子的sgRNA篩選對于FOXP3表達抑制的RBPJ蛋白關鍵功能位點。結果發現RBPJ的C末端和DNA結合功能域（都介導RBPJ與SMRT-NCOR抑制復合體的結合）的突變模擬其敲除效應可以促進FOXP3的表達。同時，EMSA和熒光報告實驗證實RBPJ直接與FOXP3的promoter區結合并調控轉錄。這些數據表明RBPJ參與構建的NCOR轉錄抑制復合體直接調節FOXP3的轉錄表達。前已述及，HDAC3是NCOR轉錄抑制復合體的重要部分，作者進一步證實HDAC3敲除可以抑制RBPJ過表達引起的iTreg分化缺陷。CHIP-seq證實RBPJ敲除增加FOXP3基因座H3ac和H3K9ac水平?？傊?，這些結果表明RBPJ-HDAC轉錄抑制復合體介導的組蛋白去乙?；{節FOXP3表達。最后，作者使用異種GvHD模型證實RBPJ敲除iTreg過繼具有和nTreg一致的存活率，同時RBPJ敲除iTreg可以在體內長時間維持Treg譜系穩定行和免疫抑制功能。

綜上所述，這項研究通過全基因組CRISPR篩選結合體內外實驗鑒定RBPJ是人iTreg的重要負調控因子。RBPJ通過和HDAC3與NCOR1/2等構成轉錄抑制復合體抑制FOXP3的表達進而抑制iTreg的分化、功能和穩定性?？傊隧椦芯繛閕Treg分化和功能維持的分子機制以及開發靶向Treg的炎癥疾病治療提供新的理解和靶點。

https://doi.org/10.1038/s41586-025-08795-5

制版人： 十一

參考文獻

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2. Kathrin, Schumann., Siddharth S, Raju., Michael, Lauber., Saskia, Kolb., Eric, Shifrut., Jessica T, Cortez., et al.(2020). Functional CRISPR dissection of gene networks controlling human regulatory T cell identity.Nat Immunol, 21(11), 0. doi:10.1038/s41590-020-0784-4

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5. Ye, Zheng., Steven, Josefowicz., Ashutosh, Chaudhry., Xiao P, Peng., Katherine, Forbush., Alexander Y, Rudensky.(2010). Role of conserved non-coding DNA elements in the Foxp3 gene in regulatory T-cell fate.Nature, 463(7282), 0. doi:10.1038/nature08750

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