The neural crest as a bioelectric Rosetta Stone- translating the analog and digital bioelectric code with Fluorescent Lifetime Imaging (FLIM)

神經嵴作為生物電的“羅塞塔石碑”：通過熒光壽命成像（FLIM）解讀模擬和數字生物電密碼

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摘要：

破譯生物電碼仍然是生物電干預在生物醫學領域廣泛轉化的核心挑戰之一，同時也是更深入理解發育過程中的離子信號如何演變為神經智能的基礎。因此，開發能夠對多種生物電參數進行定量研究的模型系統和實驗方法至關重要，特別是在活體狀態下，并將其與細胞和組織層面的結果相聯系。在此，我們應用最先進的熒光壽命成像（FLIM）光學技術對膜電位（Vmemoe）進行定量檢測，追蹤了非洲爪蛙（Xenopus laevis）神經嵴細胞在約18小時時間跨度內的生物電動態變化。我們識別出一種在數小時尺度上起作用的緩慢“模擬”生物電成分，以及一種在數秒尺度上起作用的快速“數字”成分。隨后，我們利用信息論分析表明，神經嵴細胞（NCC）膜電位的“數字”動態與鈣離子動態基本相互獨立。最后，我們對多種生物電事件進行了綜述，揭示了集體生物電動態的深層復雜性，這種復雜性可能涉及隧道納米管在信號傳遞中的作用，為今后的研究指出了多個值得探索的方向。

引言

生命的語言翻譯

在古埃及帝國滅亡之后，其象形文字語言失傳于歐洲學者，使他們無法獲得關于自身更現代文化基礎的重要見解。羅塞塔石碑（Rosetta Stone）的發現——一塊以古埃及象形文字、古埃及通俗體文字以及可理解的希臘文書寫同一信息的石碑——使得學者們得以破譯這門失落的語言，并獲取其中隱藏的秘密。當代生物學家面臨著與19世紀埃及學家類似的挑戰：解碼我們祖先留下的古老語言，以更好地理解我們自己（見圖1A）。

使用“代碼”并不僅限于人類文化。生物學中充滿了各種編碼現象，它們發生在不同的尺度上，并由不同類型的物質實現 [1-4]。生物工程和再生醫學的進步，以及對進化生物學和認知科學的基本理解，都要求我們學會讀寫這些“代碼”。我們能否從測量中提取信息，并理性地操控分子和生物物理狀態，以在活體系統中可靠地實現復雜的系統級結果，取決于我們是否了解輸入狀態與后續結果之間的映射關系。

語言的目的在于以一種能夠提高個體之間功能協調性的方式傳遞信息，而翻譯一門語言的關鍵早期步驟是理解信息是如何被編碼的。這是讓-弗朗索瓦·商博良（Jean-Fran?ois Champollion）首次利用羅塞塔石碑破譯象形文字時的核心洞見：“象形文字是一種復雜的體系，它在同一段落、同一句子、甚至我敢說同一個詞中，同時具有具象的、象征的和語音的書寫形式。”（引自[5]）。為了理解發育和再生形態發生過程，以及細胞協作失調所導致的疾病（如癌癥），我們必須明確細胞之間發生的多種通信路徑，以及細胞如何解讀生物物理狀態，從而將功能協調導向適應性和一致性的解剖結構結果 [6, 7]。正如象形文字一樣，我們假設生物電可能以多種方式并行編碼信息，展現出一種可解析且具有生物醫學意義的模態，在物理學與符號學交匯之處發揮作用 [2, 8]。

在生命系統中用于編碼的一種特別有趣的物理媒介就是生物電。神經科學通過神經解碼的研究項目 [9-12]，主要基于這樣一個觀點：心理內容、靈活導航問題空間以實現適應性結果的能力，是以電生理狀態進行編碼的。然而，生物電網絡并非首先出現在大腦中——它是一種古老的編碼和使用信息的方式，可以追溯到細菌生物膜 [13]，并在作為調控形態空間穿越行為的前體中得到充分發展，從而控制運動性 [14, 15]。我們之前曾提出，電生理學在大腦中所起的整合功能——即協調大量神經元以實現個體行為層面的結果——也延伸至（并源自于）發育生物學中非神經細胞之間合作以達成復雜統一解剖結果的需求 [7, 16]。這表明，神經解碼領域 [9-12] 應當擴展到身體其他組織，特別是那些正在進行活躍模式形成的組織 [16]。

生物電：一種原始的細胞語言

越來越多的研究證據表明，非神經系統的生物電在發育、再生、癌癥進展和進化過程中發揮著重要作用 [17-19]（見圖1B）。電壓參數調控干細胞分化 [20-24]、增殖 [25-29]、基因表達 [30, 31]，以及細胞對經典生化信號因子的解讀 [32-35]。即使在“主調控基因”pax6無法誘導眼睛形成的區域中，離子通道的異常表達也能在非洲爪蛙（Xenopus）胚胎中誘導出異位眼睛的形成 [36]。生物電還調控果蠅（Drosophila）翅膀的發育 [37]、斑馬魚（zebrafish）鰭的大小 [38]，以及脊椎動物心臟、大腦和面部的形態模式 [39-42]。它還被認為參與了飛魚高度特化的鰭的進化過程 [43]。已有研究表明，生物電干預可以在非再生性條件下恢復再生能力 [44, 45]，克服化學和遺傳因素引起的致畸作用 [46]，并使由人類癌基因誘導的類似腫瘤結構恢復正常 [47-50]。

由于存在多種可誘導復雜協調下游反應的干預試劑——即“電療藥物”（electroceuticals），其中許多已獲美國食品藥品監督管理局（FDA）批準用于神經醫學和其他適應癥 [51, 52]，生物電也成為具有吸引力的生物醫學干預途徑。然而，在預測生物電干預結果、診斷病理背后的生物電成因，以及將生物電整合進更廣泛的細胞、分子和發育生物學知識體系方面，我們仍面臨巨大挑戰。這主要是因為要在生理上有意義的時間尺度上觀察和解讀生物電模式的動態變化，技術難度極高。生物電是一種復雜的計算媒介 [53]，不能通過簡單的“一對一”輸入輸出關系進行控制。為了操控生物電代碼，我們必須首先能夠“讀取”它。本文中，我們報告了利用一種被稱為“神經嵴”的胚胎細胞群體作為模型系統，以研究與發育相關的信息是如何被生物電信號編碼的 [54-57]。

神經嵴：一種生物電的羅塞塔石碑

神經嵴是一類具有多能性的干細胞群體，位于神經與非神經發育模式之間的交界處，最終可分化為神經和非神經類型的細胞 [58-61]。神經組織由脊索（一種短暫存在的中軸組織結構）分泌的誘導信號所觸發。那些從脊索接收到不足誘導信號的外胚層細胞保持為非神經細胞，而接收中等劑量信號的細胞則成為神經嵴細胞，它們可以向神經或非神經命運發展。

神經嵴細胞（NCCs）作為一個整體、以“智能化”的方式在胚胎中遷移，并最終形成多種多樣化的細胞類型，包括周圍神經系統神經元、心臟細胞、黑色素細胞、以及顱骨和軟骨等。尤其與我們的研究相關的是，神經嵴細胞已被多次證明具有活躍的生物電活動。例如，兩棲動物的神經嵴細胞會通過電趨化作用朝向外源施加電場的陰極方向遷移 [64, 65]。此外，多個關鍵生物電效應因子的突變都會阻礙神經嵴的正常發育，包括鉀離子通道 [66, 67]、鈣離子通道 [68]、縫隙連接蛋白 [62, 63]，以及機械敏感性非選擇性陽離子通道Piezo1 [69]。

由于神經嵴細胞處于神經與非神經細胞之間的中間狀態，我們將其設想為一種“生物電的羅塞塔石碑”，可能有助于翻譯不同形式的離子信號。正如羅塞塔石碑幫助考古學家理解了一種前代文明的語言，從而更好地理解自身現代文化的基礎一樣，我們提出對神經嵴的生物電研究將使我們能夠把神經科學中強大的理論和方法進展應用于更古老的非神經生物學功能之中；反過來，這也將提供關于原始認知機制的新見解，從而加深我們對大腦演化與功能的理解（見圖1A）。

除了作為神經與非神經細胞行為之間的中介這一吸引力之外，神經嵴細胞也是研究集體細胞行為的重要模型 [70-76]。神經嵴細胞群體可以集體地趨化至化學引誘物Sdf1a所在的位置，但單個細胞卻無法做到這一點 [77]，這表明整體大于部分之和。表達顯性失活型Sdf1a受體CXCR4的細胞，在與野生型細胞混合后也能恢復趨化能力 [77]，進一步證明了這種組織的集體性質。神經嵴細胞的集體性不僅體現在功能上，也體現在結構上，因為神經嵴細胞可以在體外和體內形成超細胞級的肌動蛋白束，驅動整個細胞群的遷移 [78]。

根據威廉·詹姆斯（William James）對智力的定義——即通過不同路徑實現相同目標的能力——神經嵴細胞展現出顯著的“集體智能”[15, 79]。它們表現出非凡的適應能力：例如，在受到消融損傷時，它們可以通過非經典的路徑遷移到缺失區域 [80, 81]（類似于神經元的行為 [82]），并且可以根據需要調節自身數量的增減，以實現正確的靶器官形態 [83]。也許最令人印象深刻的是，將小鼠神經嵴細胞移植到雞胚胎中后，它們能夠在新的環境中成功導航，并在雞喙中形成牙齒 [84]。

這種復雜且高度可塑的行為特征表明，神經嵴細胞具有內在的高度復雜性和環境依賴性行為，使其成為一個極具吸引力的研究模型，用于探索生物電信號傳導，以及更廣泛的解剖狀態空間中的集體行為 [85]。

解讀生物電碼中的信息

神經系統的生物電信號具有極快的速度、復雜的結構，并且單位時間內電壓變化的幅度非常大。相比之下，更為原始的非神經系統生物電信號則要緩慢得多，幅度也更弱。肌球蛋白（myosin）為理解生物電提供了一個有用的類比。肌肉中含有高度特化的肌動蛋白-肌球蛋白系統，能夠產生宏觀尺度上的力量。而在真核生物中還廣泛存在一種非肌肉型、特化程度較低的肌球蛋白，它驅動細胞運動以及細胞和組織的收縮性 [86]。盡管它們在分子機制上具有保守性，但研究個體與細胞運動所需的工具卻大不相同。

同樣地，雖然針對神經生物電信號，科學家們已經開發出了諸如膜片鉗、全細胞記錄和多電極陣列（MEAs）等強大的工具，但對于讀取非神經生物電信號的技術手段仍十分有限 [87-89]。

神經科學家在一定程度上通過鈣成像技術繞過了這些挑戰，這種技術可以相對無創地對大量細胞進行長時間同步測量 [90, 91]。雖然生物電干預可以在發育過程中改變鈣信號 [92]，但目前尚不清楚鈣信號在多大程度上真實反映了非神經系統的生物電通信，尤其是在較長時間尺度上 [93]。具體來說，已有研究表明，除了電壓門控鈣通道的開啟之外，還有多種從電壓變化到基因表達變化的轉導機制。因此，僅靠鈣信號的讀數不太可能全面反映細胞對內源性生物電事件的復雜反應 [94]。

Evan Miller 的研究團隊開發出了一項有前景的技術，將他們的 VoltageFluor（VF）染料系統與高定量性的成像工具——熒光壽命成像（FLIM）相結合 [95, 96]。VF 染料由熒光團、分子導線和電子供體猝滅劑組成（見圖2A）。它們像圖釘一樣插入細胞膜中，一旦插入，其熒光強度和壽命會隨著局部電場方向的變化而變化：當電場將電子推入熒光團時（超極化），熒光強度和壽命降低；而當電場將電子拉出時（去極化），熒光強度和壽命增加。

由于熒光壽命是熒光團的固有屬性，不會直接隨染料濃度變化，FLIM 在很大程度上避免了因染料攝入差異或細胞形態變化帶來的干擾（見圖2B-D’’’）。這對于讀取那些通常幅度微弱、時間跨度較長的非神經生物電信號至關重要，因為即使是輕微的偽影也可能掩蓋這些信號。我們使用 FLIM 結合具有高度光穩定性的遠紅 VF 染料 BeRST [97]，首次在原代組織外植體中實現了超過17小時、幾乎無光毒性和光漂白的長期生物電成像。

在此基礎上，我們試圖揭示信息是如何在生物電信號中被編碼的。我們的方法基于克勞德·香農（Claude Shannon）對“信息”的定義 [98]，該定義在數學上類似于熱力學中的熵，隨著系統狀態多樣性的增加而增加。我們在文獻 [99] 中深入討論了信息論在生物信號識別中的應用，并將其應用于相對靜止的非洲爪蛙（Xenopus laevis）動物帽外植體中的細胞骨架和鈣信號動力學分析。

香農信息量高的系統通常具有高度的狀態多樣性，因此這類系統最適合作為生物電通信模態的研究對象。本文中，我們將這一方法擴展至映射先前未被描述的、光學估計的膜電位（Vmem）與鈣離子動態之間的信息流動，追蹤遷移中的神經嵴細胞外植體在較長時間內的動態變化。我們發現，與神經元不同 [90, 91]，神經嵴細胞中的 Vmem 和鈣動態基本相互獨立，這揭示了多細胞背景下離子信號演化的一個引人注目的方面 [14, 100-102]。

方法

青蛙飼養與mRNA注射

動物護理遵循塔夫茨大學（Tufts University）機構動物護理和使用委員會（IACUC）批準的協議編號M2023-18的規定進行。使用mMessage Sp6體外轉錄試劑盒（ThermoFisher）生成帶有帽子結構并加標簽的mRNA。在胚胎發育至2-4細胞階段時，對其進行顯微注射，每次注射體積約為0.9μm外徑的劑量。注射的mRNA混合物包含600 ng/μL的jGCAMP8s mRNA [103]、10 ng/μL的mCherry-Erk2 [104]，以及200 ng/μL的LifeAct-Turquoise2 [105]，全部溶解于無RNA酶水（Ambion）中。

pLifeAct-mTurquoise2質粒由Dorus Gadella惠贈（Addgene質粒#36201；http://n2t.net/addgene:36201；RRID:Addgene_36201）。

pHR SFFVp BFP-Erk2質粒由Wendell Lim惠贈（Addgene質粒#50848；http://n2t.net/addgene:50848；RRID:Addgene_50848）。

神經嵴（NC）在纖維連接蛋白（FN）包被蓋玻片上的外植培養

神經嵴外植操作參考并改進自 Gouignard 等人于 2021 年的方法 [106]。為盡量減少因更換多種培養基帶來的生物電效應，神經嵴的分離操作均在 Danilchick’s For Amy（DFA）培養基 [107] 中進行。

神經嵴外植操作在神經管閉合前的神經胚形成期進行（NF 階段 15–17）。多個傳感器的mRNA共注射結合胚胎在22°C條件下的原腸胚發育階段飼養，會引發輕微的異時性發育（heterochrony）。盡管我們努力從發育階段相似的胚胎中取材，但由于存在時間窗口的不確定性，我們報告了一個相對保守且較大的階段范圍。為了減輕發育階段差異的影響，我們在每次取出的神經嵴組織中切割出4-5個外植塊，將它們在DFA緩沖液中混合均勻后隨機分配到各實驗組中。

本研究共進行了三次獨立重復實驗，分別使用來自不同批次的受精卵。在每次重復中，我們將三種不同鉀離子（K+）濃度條件的樣品在孔板中的空間位置進行輪換，以減少因孔位或成像順序可能帶來的干擾因素。

由于目前尚無法確認每個外植細胞的確切分子身份（此類驗證通常需要遺傳編碼的報告系統或組織固定，而這兩種方法均與我們的分析不兼容），因此我們避免將這些樣本稱為“神經嵴細胞”，而是采用術語“神經嵴外植體”（neural crest explants），以承認其中可能存在污染組織或向特定組織類型分化的可能性。

光學估計膜電位（Vmemoe）

雖然熒光壽命成像（FLIM）顯著提高了生物電成像的定量能力，并可在不影響細胞完整性的前提下對大量細胞進行長時間監測，但不能期望其在所有細胞類型和所有時間點上都具有與經典電生理技術相同的精確度。染料內化、染料滯留引起的偽影、膜電位無關的壽命變化以及其他不可預見的技術限制，都是當前技術狀態下的必要妥協。

然而，光學測量不會引入傳統侵入性電生理技術所帶來的一系列干擾因素 [87]。為避免混淆，本文中我們使用術語“光學估計膜電位”（Optically Estimated Vmem），簡稱 Vmemoe。

染色處理

外植體在含有以下成分的標準 DFA 緩沖液中染色30分鐘：4.5 mM K+ 葡萄糖酸鹽、50 μL Nuc Blue 染色試劑（Hoechst 33342，Invitrogen R37605）以及5 μL 0.5 mM BeRST DMSO 儲存液（由 Evan Miller 惠贈，Pharmaron 合成，中國）。染色過程在22°C避光環境中進行。

為最大程度減少對外植體的擾動，染色液逐步加入至8孔玻璃底培養皿（Ibidi）中，并在各孔之間混勻以確保染色均勻。

成像

成像使用 Leica Stellaris 8 共聚焦顯微鏡完成。相關成像參數及元數據文件目錄詳見補充材料中的表格1（作為PDF文件提供）。

長期成像在20°C條件下進行。對于圖3–6中討論的定量數據集，使用了來自不同批次受精卵的獨立重復實驗。每種實驗條件下共成像9個外植體，每次成像會包含3個外植體。三個重復實驗之間因載物臺移動速度略有差異，導致總成像時間相差僅幾分鐘，在超過17小時的總觀察時間下可以忽略不計，因此將這些重復實驗的數據合并分析。

圖中展示的圖像可能來自0.5 mM K+、4.5 mM K+ 或 8.5 mM K+ 條件，除非另有說明。部分圖像在 Fiji 軟件中進行了無插值放大處理，以生成更清晰的圖表和視頻素材。

圖像分析

sX FLIM 定量分析：使用 LasX FLIM/FCS 模塊進行曲線擬合。雖然 Lazzari-Dean 等人 [95] 對 VF2.1.Cl 使用雙指數衰減擬合，而對 VF2.0.Cl 使用單指數衰減擬合，但由于光子計數相對較低，我們對所有熒光染料均采用了單指數擬合。在圖3至圖6所示的時間序列數據中，BeRST 的壽命圖像在導出前在 LasX 中進行了合并（binning），以通過增加每次擬合中的光子數量來改善曲線擬合效果，之后在 Fiji [108] 中使用雙線性插值方法或在 CellProfiler 中進行放大處理。

全器官整體定量分析：從 LasX 中將器官整體的時間序列數據分別導出為強度通道和壽命通道。應用每計數 1 的強度因子和每計數 0.001 的壽命因子，使得 16 位圖像可以按皮秒單位縮放以便分析。除非由 CellProfiler 處理，否則二值掩膜是通過 BeRST 強度通道或 NucBlue 信號生成的。

Kymograph（時空圖）制作：使用 NucBlue 信號對目標通道進行掩膜處理后，在 ImageJ 中運行“Radial Reslice（徑向切片）”工具，并生成平均強度投影圖。半徑從圖像中繪制。圖像格式為 32 位，背景設置為 NaN，以防止低于閾值的像素影響數據。正導數圖像通過將一張圖像與下一個時間點的圖像相減并舍棄所有負值生成。

CellProfiler 核輪廓提取：我們的 CellProfiler [109, 110] 分析流程見附錄方法1。在本研究中，CellProfiler 僅用于生成補充視頻7中的細胞核輪廓。

與鈣離子kymograph的信息分析

Kymograph 圖像被裁剪至 240 像素高度，去除了最外側像素，并使用一個手動設定的閾值進行二值化處理；所有 kymograph 使用同一個閾值，所有鈣離子 kymograph 使用另一個閾值。隨后，y 軸以 16 倍因子進行中值合并（median-binned），生成一幅高度為 15 像素的圖像，每個像素代表厚度為 16 像素的一系列同心圓的平均值。將所得 kymograph 的 x 軸替換為時間軸，使原本的單幅 kymograph 圖像轉換為一個時間序列圖像，其厚度為 1 像素，高度為 15 像素。兩個時間序列圖像隨后在空間上放大 100 倍，并被分割成每個原始像素作為一個獨立的感興趣區域（ROI），構建一個馬賽克式的時間序列圖像：左側顯示鈣離子值，右側顯示 值，并保存為 .avi 格式文件。隨后使用信息論軟件包 CAIM [111] 從每個 ROI 中提取時間序列數據，計算每種信號模式在每個 ROI 中所包含的信息量（Information），以及每個通道之間、每個 ROI 之間的互信息量（Mutual Information）。

數據在 Excel 中進行處理，并在 Prism 中進行統計分析和繪圖。統計顯著性通過Friedmann 檢驗（Friedmann’s test）結合Dunn 多重比較檢驗（Dunn’s multiple comparison test）進行判定。

生物電事件大小估計

使用上述信息分析中得到的二值化數據，用于估算每個器官整體內生物電事件的平均大小。從每個時間點中測量出至少在一個通道（Vmemoe 或 Calcium）中存在活躍 ROI 的樣本中，統計含有信號的 ROI 平均數量，并據此確定每個器官整體的平均事件大小。對于未包含至少一個 Vmemoe 事件和一個鈣離子事件的器官整體樣本予以排除。統計顯著性使用 GraphPad Prism 進行配對 t 檢驗（paired t-test）計算。

掃描速度對生物電事件動態的影響估計

我們觀察到與掃描方向垂直的線性信號。為了估計每條掃描線的停留時間（dwell time），我們將圖像幀采集持續時間除以構成該幀的掃描線條數。隨后，我們在 ImageJ 中沿掩膜后的壽命圖像（背景像素設為 NaN，不參與分析）繪制一條與掃描方向平行的線，并手動定義其足夠寬以涵蓋整個生物電事件，同時盡量減少鄰近細胞的干擾。我們使用 ImageJ 的“Plot Profile”工具提取壽命在空間上的變化，并利用估算的掃描線停留時間將空間維度轉換為時間維度，最終繪制出壽命隨時間變化的曲線圖（lifetime vs. time plot）。

統計學方法

我們參考了 Lazic 等人 [112]、Lord 等人 [113] 以及 Motulsky [114] 的文獻作為統計分析的指導。來自不同動物的多個神經嵴被切割成更小的器官整體，并被隨機分配至不同的 K+ 條件中。由于隨機化是在器官整體層面進行的，因此樣本量被定義為器官整體的數量，并將不同的器官整體作為統計的重復樣本。這些器官整體取自 3 批獨立的孵育批次，并在 3 次獨立的成像實驗中進行觀察，三種條件均在相同時間并行成像。

出于效率考慮，我們在統計分析中并未明確考慮批次（clutch）和成像實驗（imaging session）層面的潛在變異性；盡管如此，在圖 3A 中我們使用了三種不同顏色的點來表示這三個重復實驗。由于長期的時間序列成像較為耗時，為了提高統計效能，在信息分析和事件大小估計中，我們將所有三種 K+ 濃度條件的數據合并在一起進行分析，并使用不同顏色標注每個數據點所屬的實驗條件。在事件大小估計中，排除了那些既沒有 Vmemoe 事件也沒有鈣離子事件的器官整體。

統計檢驗使用 GraphPad Prism 10.4.0 軟件進行，操作依據該軟件的推薦指南 [114]。

結果

與任何新信息媒介或編碼方式的研究一樣，要使用模型系統來破解生物電碼（bioelectric code），需要了解其所具備的生物電特性類型（如模擬信號 vs. 數字信號、信號“幀率”、單位面積內可攜帶不同狀態的能力等帶寬參數），以及這些特性如何對刺激做出響應。我們以非洲爪蟾神經嵴（Xenopus neural crest）為模型進行了以下研究。

三種染料的生物電熒光壽命成像揭示了傳統非FLIM成像中被掩蓋的空間生物電差異

我們假設，在擴散中的神經嵴器官整體中存在一些通過僅依賴熒光強度的傳統成像方法難以檢測到的細微生物電模式。為了驗證這一假設，我們使用一組三種生物電染料，通過強度和壽命兩個維度對膜電位（Vmem）模式進行了光學評估。

我們最近描述了一種策略 [115]，用于通過對照染料 VF2.1.Cl 驗證 BeRST 檢測到的生物電模式的特異性。VF2.1.Cl 的壽命特性已通過電生理學方法嚴格量化 [95]；而 VF2.0.Cl 是 VF2.1.Cl 的陰性對照變體，缺乏賦予 Vmem 敏感性的電子供體淬滅基團。我們發現，將 BeRST 與 VF2.0.Cl 共染色會顯著降低 VF2.0.Cl 信號的壽命和變異性，提示兩者之間可能存在 FRET 相互作用（數據未顯示）。因此，我們避免將 BeRST 與 VF2.1.Cl 或 VF2.0.Cl 共染色，而是分別在不同的器官整體上進行染色。結論基于來自兩個獨立批次的數據：其中 9 個器官整體用 VF2.0.Cl 染色，8 個用 VF2.1.Cl 染色，13 個用 BeRST 染色。不同器官整體之間的成像條件略有調整以生成可比圖像。圖 2 中展示的器官整體并非來自注射胚胎，以防止構建體與 VF2.0.Cl 和 VF2.1.Cl 之間發生串擾。

比較三種染料的強度（B–C''）和壽命（D–D''）成分，展示了 FLIM 在讀取生物電狀態方面的價值。在強度圖像中，細胞形狀似乎在表觀膜電位（Vmem）中起著主要作用。使用所有三種染料時，細胞重疊區域由于局部染料濃度升高，呈現出相對去極化的狀態，形成一個環狀結構，這在壽命圖像中并不存在。圖 2B' 和 C' 顯示了對 Vmem 敏感的染料 VF2.1.Cl 的強度圖像，尤其具有誤導性，因為它們暗示中央細胞簇比正在遷移的單個細胞更去極化。然而，這種模式也出現在使用對 Vmem 不敏感的 VF2.0.Cl 的 B'' 和 C'' 圖像中，強烈表明這些是假陽性結果。面板 D' 和 D'' 的 FLIM 數據進一步支持了這一結論：VF2.1.Cl 染色的器官整體呈現出不同于 VF2.0.Cl 對照組的模式，后者更為均勻。因此，FLIM 去除了主要的噪聲來源，并揭示了原本被掩蓋的細微生物電模式。

不過我們也觀察到了一些差異，提示可能存在偽影。在 VF2.1.Cl 和 VF2.0.Cl 中偶爾可見在組織密集區壽命降低的現象（圖 3F, G，星號）。這種現象在 BeRST 中并未出現，事實上恰恰相反，密集組織往往表現出升高的壽命，與去極化一致（圖 3D'', D''', E，星號）。VF-FLIM 已知的一個偽影是在高染料濃度下會發生自淬滅 [95]。由于前遷移期器官整體密度較高，且我們希望以盡可能少的光子實現長期成像，因此我們使用了相對較高濃度的 BeRST（5 μM）以提高滲透均勻性。相比之下，VF 類染料在組織中的滲透效果優于 BeRST，意味著其局部濃度可能更高。我們將這些數據解釋為：致密組織內部趨向于去極化，邊緣趨向于超極化，并且由于染料淬滅偽影的存在，這一效應可能被低估了。我們還觀察到，在 VF2.1.Cl 中軸突表現出升高的壽命，提示為去極化（D''），而在 BeRST 中則表現為超極化（圖 2F'''）。BeRST 報告的超極化更符合現有的生物物理模型，說明 VF2.1.Cl 可能存在某種偽影。但出于謹慎考慮，我們在尚未解決這一矛盾之前，暫不解讀本文中任何關于軸突的模式。

在（圖 2E–G'''）中，我們展示了使用 BeRST 染色并在相同條件下培養約植板后 20 小時拍攝的一組 NC 器官整體的 Vmemoe 圖像。FLIM 為每個像素提供兩個獨立數據集：強度（即光子計數），這是熒光共聚焦顯微鏡的標準輸出；壽命（fluorophore 處于激發態的時間長度），以納秒為單位報告。我們以三種方式呈現這些數據：第一，僅顯示強度圖像，展示標準生物電成像所檢測到的模式（圖 2E–E'''）；第二，同時顯示強度和壽命，其中像素亮度由強度決定，顏色由壽命決定（圖 2F–F'''）。這是 LasX FLIM 模塊的默認輸出，結合了強度提供的細胞形態線索，但掩蓋了部分壽命數據的定量能力。第三，我們使用強度圖像作為掩膜，對壽命圖像進行處理，并采用自定義調色板（LUT）著色（圖 2G–G'''）。這種呈現方式最具定量性，最能顯示低幅度變化。在圖 2 之后的圖像中，除非另有說明，我們一般都使用僅壽命的呈現方式，因其具有更強的定量能力。

綜上所述，這些數據顯示 FLIM 能夠檢測到在僅依賴強度的傳統熒光生物電成像中被掩蓋的細微生物電差異。此外，它們也強調了僅依賴強度成像可能導致“假陽性”生物電模式的風險，而這些問題可通過 FLIM 得以緩解。然而，它們也揭示了移植后的 NCCs 中驚人的細胞間生物電多樣性，尤其是在從較大群體中分離出來的細胞中。那么，這種多樣性是如何產生的？它們是短暫波動的表現，還是持久的靜態細胞差異？為了回答這些問題，我們利用了生物電成像的主要優勢之一：能夠在較長時間內并行觀察大量細胞群體。

時間維度上的生物電變化：NCC 器官整體在從秒到小時尺度上表現出多尺度生物電信號

在確認了生物電狀態的空間差異之后，我們接下來研究了在神經嵴細胞遷移過程中，生物電模式如何隨時間演化，以及這些模式對通過改變培養基中 K? 濃度所進行的生物電干預作何反應。生物電成像極大地擴展了我們檢測生物電模式的時空范圍。我們利用這一高靈敏窗口，在大約 17 小時的時間范圍內探索膜電位（Vmem）動態變化，這段時間內神經嵴器官整體逐漸擴散、集體遷移，并開始從群體中分離出來進行個體遷移。

正如我們在圖 1B 中所概述的那樣，生物電領域面臨的最大挑戰之一是預測生物電干預后的表型結果。細胞是否會迅速補償干預并恢復到設定的 Vmem？還是會長時間保持去極化或超極化狀態？生物電動態是被嚴格控制從而阻止細胞進入新狀態，還是僅僅整體向去極化或超極化水平偏移？為了回答這些問題，我們進行了平行的縱向研究，對改變外部鉀離子濃度的 NCC 器官整體進行觀察，以測試細胞外離子水平對長期生物電模式的影響。我們對器官整體時間序列圖像進行了整體壽命分析，以估算整個實驗過程中的全局 Vmem 模式，方法是通過對圖像的強度成分進行閾值處理，去除暗像素的干擾。由于此方法不需要圖像分割，因此相對無偏倚，但更容易受到諸如細胞死亡和染料內化等偽影的影響。

我們首先想觀察是否能在 BeRST 壽命數據中檢測到改變 K? 濃度所帶來的影響。我們計算了每個器官整體在整個時間過程中的平均值，發現與預期一致 [116]，增加 K? 濃度會導致

升高（圖 3A）。出人意料的是，降低 K? 濃度并未顯著降低壽命（圖 3A）。在每個時間點繪制平均值后發現，0.5 mM K? 條件下的標準差大于其他兩種條件。

在三種條件下，都呈現出一致的三階段變化模式（圖 3B）。當將三種條件的數據合并后，每個階段在統計學上都明顯區別于前一階段。最初，器官整體呈現相對去極化的狀態，隨后是一個約 6.5 小時的逐漸超極化期。這種去極化通常表現為一種生物電梯度，即器官整體中心區域相對去極化，而邊緣區域更加極化（見補充視頻1）。在這一 6.5 小時期間，中心的去極化趨勢趨于平緩，隨著器官整體的超極化而減弱。初始的超極化階段之后是約 10 小時的逐漸去極化過程，第三階段與第一階段相比沒有顯著差異。

在 8.5 mM K? 條件下，第二和第三階段的顯著高于 4.5 mM K? 條件下的器官整體，而在第一階段，三種條件之間沒有顯著差異（見補充圖1）。這一模式在圖 2B 中也有所體現：8.5 mM K? 和 4.5 mM K? 條件下器官整體的平均值在第一階段差距較小，在第二階段擴大，并在第三階段維持較大差距。這些趨勢與細胞在遷移過程中 K? 通透性的內在變化相一致。

為了進一步探討 0.5 mM K? 條件下未下降這一意外現象，并結合該條件下較大的標準差（圖 3D），我們獨立地觀察了每一個器官整體的長期動態（圖 3D–F）。這些獨立觀察揭示了一些相對較短且陡峭的去極化事件，這些事件在 0.5 mM 條件下最為明顯（圖 3D，紅色星號），尤其在第二階段尤為突出。由于這些信號變化較快（以分鐘為單位），并且看起來是離散事件——其變化速度遠快于兩個穩定期之間的持續時間——我們將它們稱為“數字”信號，以區別于緩慢變化（以小時為單位）的“模擬”生物電信號。這些信號干擾了我們對 0.5 mM K? 條件下細胞靜息膜電位的測定，解釋了該條件下較高的標準差，并可能解釋為何其并未顯著低于 4.5 mM K? 條件。

對這些“數字”信號的進一步定性分析表明，它們常常涉及大量細胞，但并不一定覆蓋整個器官整體。例如在圖 4A 和 B 所示的低 K? 處理的器官整體中，它分裂成了兩個片段（見補充視頻1）。在 B 圖中，下方片段作為一個整體發生了去極化，而上方片段則基本保持不變。14 分鐘后，在 H 圖中，上方片段發生整體去極化，而下方片段則逐漸超極化。這一趨勢表明這兩個片段包含了各自獨立的動態生物電回路。我們還提供了另外兩個結合了和強度信息的例子，以展示“數字”生物電信號的多樣性（見補充視頻2和3）。

綜上所述，這些數據揭示了 NC 器官整體在擴散過程中的緩慢三階段進展：早期為相對去極化階段，中心區域去極化并向外圍逐漸超極化（第一階段）；第二階段更為超極化，此時梯度減弱，細胞開始從器官整體中分離（第二階段）；第三階段為逐漸增強的去極化（第三階段）。這些數據共同提示，隨著 NCC 遷移的推進，細胞膜對 K? 的通透性發生了變化。最后，我們在低 K? 條件下發現了快速、短暫的去極化事件的意外增加，這表明即使是極為簡單的生物電干預也可能帶來非線性的表型后果。

數字生物電動態與鈣離子動態部分重疊

在神經元中，鈣離子動態與去極化之間存在強烈相關性 [90, 91]。我們比較了膜電位（）和鈣離子模式，以確定這種關系是否也存在于神經嵴（NC）中。

鈣信號是目前非神經生物學中最深入研究的動態信號模式之一 [117, 118]，幾十年來它一直被用作動態神經信號的替代指標 [90, 91, 119]。此外，已有研究表明鈣信號在神經嵴器官整體遷移和圖式形成過程中具有活性 [120, 121]，而干擾 Ca2?/H? 通道 AMO1 [68] 和非特異性陽離子通道 Piezo1 的功能會阻礙體內 NCC 的正常遷移 [69]。鑒于動態神經信號與鈣信號之間的這種關聯，我們假設：我們在前一節中描述的數字型生物電信號可能是尚未被描述的動態非神經鈣信號范式的一個組成部分。

我們分析了時間序列數據，以尋找生物電與鈣信號之間相關性的證據。正如我們所假設的那樣，我們確實發現了與生物電信號相關的鈣信號實例（圖4C）。但我們同時也觀察到一些沒有相應鈣信號的生物電事件（圖4D），以及一些沒有相應生物電信號的鈣信號（圖4D）。基于這些數據，我們否定了“鈣信號足以作為發育中生物電活動代理”的假設，轉而得出結論：生物電與鈣信號之間存在相互作用（crosstalk），但它們之間的相關性不像在神經生物電中那樣緊密。

為了更全面地比較鈣信號與數字型生物電動態，我們采用了 kymograph 分析方法（圖5 A–O）。由于模擬信號和數字信號在變化速率上有所不同，我們通過創建“正導數”時間序列來進行解卷積，具體做法是將每個時間點的 Vmemoe 壽命值（或鈣強度值）與下一個時間點相減。未分化的圖像生成的 kymograph（圖5 D, H, L）展示了模擬系統動態，而正導數圖像生成的 kymograph 則揭示了數字動態（圖5 E, I, M）。

我們通過使用 NucBlue 核信號對時間序列進行掩膜處理，并去除核 ROI 外的所有數據點，從而生成正導數時間序列。這一閾值設定有兩個目的：一是去除了隨著時間推移在細胞內積累的內吞染料（因為裝載染料的囊泡往往被細胞核遮擋）；二是去除了由細胞運動帶來的噪聲，這對正導數方法是一個重要的干擾因素。我們也對原始圖像應用了核閾值處理。隨后，我們使用 Fiji 中的 “Radial Reslice” 工具 [108]，從圖像中心向外圍繪制了 360 個 kymograph（每間隔 1 度）。將這 360 個 kymograph 疊加為一個平均強度投影圖像，可以呈現出整個器官整體在時空維度上的動態生物電演化信息。

我們在圖5 D–O 中展示了三種條件下的代表性 kymograph。未分化的 kymograph 所顯示的模擬趨勢與我們在全器官整體分析中描述的趨勢一致（圖3）：首先是去極化，隨后是逐漸超極化，最終再次趨向去極化；從器官整體中心到外圍存在一個從去極化到超極化的梯度，該梯度隨時間逐漸減弱；而在從主體分離出來的邊緣細胞中則出現了明顯的超極化現象。外部 K? 濃度的影響也與預期一致：低 K? 條件在第 2 階段表現出更強的超極化，而 8.5 mM K? 條件在第 3 階段表現出更高的去極化。

通過對 kymograph 數據集的觀察，我們提出了兩個假設：（1）在遷移中的 NCC 中，

與鈣離子動態僅存在弱協調關系；（2）Vmemoe 動態通常比鈣離子動態具有更大的空間尺度。為了定量評估這些假設，我們應用了成熟的信息論形式體系，并使用了工具 CAIM（Calcium Imaging）[111]，這是我們之前用于量化 Xenopus laevis 動物帽細胞中鈣信號與細胞骨架通路之間信息流動的工具 [99]。

我們首先將 0.5 mM K?、4.5 mM K? 和 8.5 mM K? 條件下的和鈣信號數據合并，試圖估算這些通路在整個發育過程中可能遇到的 K? 濃度范圍內的信息特性，并提高我們的統計效力。我們計算了每個器官整體的平均信息值。在合并后的數據中，我們檢測到通路平均攜帶 0.079 比特的信息量，而鈣通路平均為 0.062 比特（圖6B），盡管這兩個值之間沒有顯著差異。

鈣信號的信息中僅有約 7% 與共享

為了驗證我們的假設，即鈣信號與 Vmemoe 在遷移中的 NCC 器官整體中僅存在微弱相關性，我們測量了每個感興趣區域（ROI）內兩個變量之間的互信息（Mutual Information），并將其與每條通路中檢測到的信息量進行比較。結果與我們的假設一致：鈣與之間的互信息顯著低于任一變量本身的信息量（圖6B），僅占鈣通路中檢測到信息量的約 7%，以及 Vmemoe 通路中信息量的約 5.6%。這些數據表明，在遷移中的 NCC 中，這兩條通路在很大程度上——盡管并非完全——是相互獨立的。

Vmemoe 事件通常比鈣信號事件涉及更多細胞

我們觀察到，事件通常比鈣信號事件涉及更多的細胞。為了驗證這一點，我們使用了前述 CAIM 分析中生成的二值化 ROI 數據，并測量了每種信號模式事件中所包含的平均 ROI 數量。未同時表現出鈣信號事件和生物電信號事件的器官整體被排除在本分析之外；我們僅關注檢測到事件的平均大小，而不考慮事件發生的次數。每個數據點代表一個器官整體中對應信號模式的平均事件大小，器官整體所屬的 K? 條件則通過數據點的顏色進行標識。

罕見生物電事件的觀察提示細胞層面的生物電決策機制

生物電成像所擴展的空間與時間范圍（圖2D）使我們能夠捕捉到一些相對罕見的事件，而這些事件若使用傳統的針電極電生理記錄方法將極難捕捉。由于這些事件自發發生的頻率較低，目前我們尚無法對其做出定量結論，但這一觀察為未來的研究提供了基礎，同時也突顯了生物電世界令人著迷的復雜性。

細胞分裂過程中 Vmemoe 升高

生物電活動在細胞周期的多個方面已被從現象學和功能層面上進行了研究 [28, 122–124]。在補充視頻4中，我們記錄了幾次細胞分裂過程中的去極化事件，其中一次如圖7A所示。這一觀察結果與此前描述的細胞周期相關的生物電模式一致 [125]，進一步驗證了 VF-FLIM 技術檢測已知生物電事件的能力。此外，生物電成像具有最小的侵入性，同時具備高時空分辨率，為解析細胞周期進展中的生物電機制提供了一個理想的平臺。

細胞或細胞群體在重新接觸原集體時發生去極化

在補充視頻5中，我們觀察到一個細胞先發生超極化，隨后脫離集體獨立遷移，在接觸到器官整體中的另一個位置后發生去極化（圖8B），并整合進新的位置。這種接觸似乎由隧道納米管（tunneling nanotubes）介導 [121, 126–132]。我們也觀察到類似的現象出現在細胞群體中：當群體中最靠近原集體的成員重新接觸更大的集體時，整個群體會同步發生去極化（見補充視頻6和7）。這種即時且長距離的響應提示，接觸介導的生物電信號可能在調節 NCC 遷移過程中的擴散速率和程度方面發揮了作用，盡管其具體功能仍有待進一步研究。

掃描偽影揭示了動態信號動力學

我們觀察到，在 18℃ 條件下培養約 22 小時的器官整體中，將 K? 濃度從 4.5 mM 切換為 0.5 mM 后，似乎會引發類似于在 20℃ 下成像過程中所觀察到的第二階段中的生物電信號。我們利用這一現象，在更高放大倍數下對快速生物電事件進行了觀察（見補充視頻2和3）。在這些條件下，我們偶爾觀察到一些與 y 軸成像方向完全平行的筆直去極化條紋。由于我們使用的是逐線掃描（line-scanning）成像方式，我們認為這些線條是發生在連續掃描線之間的數字型生物電信號。

假設這些生物電信號在整個細胞范圍內是一致的，我們可以利用沿 x 軸方向、穿過 ROI 的線掃描速率來估算該生物電信號的動力學。我們發現這些信號可以重復出現，并具有相對較快的激活動力學（on-kinetics）和較慢的失活動力學（off-kinetics）（圖9C’，C''）。不同細胞之間這些信號的頻率存在差異，提示其背后的離子通道機制可能具有多樣性，盡管這些信號通常持續時間在秒級。值得注意的是，圖 C’ 中的細胞直接接觸多個類似軸突的突起，這提示神經元活動可能在產生或調節某些數字型生物電信號中發揮了作用。

更引人注目的是，我們發現這些數字型生物電信號可以在細胞群體中長距離傳播，甚至傳導至核心群體之外的細胞——這些細胞很可能僅通過隧道納米管（tunneling nanotubes）相互連接（圖7C'''）。在此情況下，若假設群體內激活是均勻的，我們便可以估算整個群體的數字型生物電信號動力學，并發現了一種區別于 C’ 和 C'' 中所示模式的第三種生物電動力學模式。這些信號在激活和失活動力學上的多樣性，為我們窺探非神經生物電事件的時間編碼機制提供了誘人的線索，但由于這些事件相對罕見，在沒有進一步實驗優化的情況下尚無法進行深入解讀。

神經嵴器官整體突起的生物電活動

由于 BeRST 可以對細胞膜進行染色，因此它能有效突出顯示那些具有較高膜質比（細胞膜與細胞質比例）的結構，如隧道納米管（tunneling nanotubes）及其他類型的細胞突起。已有研究表明，這些突起能夠介導長距離的細胞間通訊 [129]，包括通過間隙連接（gap junctions）進行的生物電通訊 [126, 128]。

在如圖7D所示的少數罕見案例中，我們觀察到細胞體的去極化信號延伸至其隧道納米管。值得注意的是，多個細胞的隧道納米管會同步發生去極化，這表明細胞群體的生物電影響范圍遠大于其細胞體所占空間所表現出的程度。這一現象也與我們此前發現的 Vmem 通路相較于鈣信號通路具有相對更高的互信息結果一致。

更廣泛地說，隧道納米管體積微小，使用現有技術幾乎無法進行膜片鉗記錄等傳統電生理測量，而這一發現表明，生物電成像可能成為研究其動態行為的一個有力工具。

羅塞塔石碑的價值主要在于它揭示了古代語言與現代語言之間的相似性與差異。同樣地，我們對神經嵴細胞（NCC）的研究旨在揭示神經信號與非神經及神經生物電信號之間的異同。我們描述了生物電成像中的一些關鍵誤區，并討論了 FLIM（熒光壽命成像）如何幫助克服這些問題。接著，我們描述了在數小時內緩慢演變的“模擬型”生物電模式，以及在秒級時間尺度上快速發生的“數字型”生物電信號。隨后，我們應用信息理論表明，不同于動作電位 [90, 91]，這些數字型生物電信號與鈣信號大多互不相關。最后，我們討論了這些比較對于神經生物電活動發生起源的意義。

FLIM 在揭示生物電模式中的價值

本文最具普遍意義的發現之一是：僅依賴熒光強度檢測生物電模式所帶來的風險。大量干擾噪聲不僅掩蓋了細微的生物電模式（比較圖2C’和2D’），更嚴重的是，還可能產生假陽性信號（比較圖2C''和D''）。由于我們的研究需要進行長期成像，因此在檢測鄰近 NCC 的組織污染或多功能 NCC 分化為多種后代細胞方面存在局限。我們的工作揭示了 NCC 遷移過程中令人驚訝的生物電信號多樣性，為未來研究奠定了基礎，以解析組織間相互作用、細胞分化以及不同 NCC 衍生物之間串擾對 NCC 生物電碼的現象學與功能貢獻。

理解離子信號在協調細胞行為中的作用，其應用范圍廣泛，涵蓋進化發育生物學 [102, 133]、出生缺陷與損傷修復的生物醫學 [41, 134, 135]，以及可編程生物機器人中多種細胞類型的使用 [136]。

模擬型生物電碼

遷移中的器官整體遵循一個緩慢的三階段生物電軌跡，這一過程持續數小時（圖3A–G，補充視頻1）。第一階段表現為明顯的梯度，內部細胞相對去極化，邊緣細胞則更為超極化；第二階段，隨著整個器官整體逐漸超極化并開始解體，該梯度減弱；第三階段，器官整體再次去極化。盡管趨勢一致，但各器官整體的實際估計生物電值存在較大差異，這表明沒有固定的門控閾值，因此我們將這些信號稱為“模擬型”信號。

K? 濃度對 NCC 器官整體生物電動態的影響

生物電干預如何影響生物電信號？這是生物電領域面臨的一大挑戰：設計能夠可靠引發特定表型結果的生物電干預手段（圖1）。這對于再生醫學和癌癥治療等領域的治療干預至關重要 [137, 138]。在此，我們通過測量一種常見的生物電干預——改變細胞外 K? 濃度——在較長時間內的影響，邁出了彌合這一差距的關鍵一步。正如之前研究所預測的那樣 [116]，提高細胞外 K? 濃度似乎導致細胞去極化。然而，降低 K? 并未顯著引起超極化。我們進一步發現，降低細胞外 K? 會意外增加快速“數字型”生物電信號，說明即使是簡單的生物電干預也可能帶來重大的非線性效應。目前尚不清楚低 K? 如何促進數字型生物電信號的機制，不過值得注意的是，大腦中低 K? 與睡眠有關 [139]，因此我們的發現可能對睡眠的原始進化起源具有啟示意義。

數字型生物電碼

數字型生物電信號可能扮演什么角色？越來越多證據表明，時間編碼的信號動態是信號轉導中被低估的一個重要元素，相同的生長因子以脈沖形式或靜態輸入方式施加會產生不同的效果 [140–143]。鑒于神經生物電信號本質上是數字型的，可以推測它們的原始非神經對應物也應具備時間編碼特性。我們在圖7C 中報告的激活與失活動力學差異提供了誘人的線索，提示可能存在一種非神經數字型生物電信號的時間編碼詞匯。雖然這些事件較為罕見限制了我們的研究能力，但未來若能更好地對其加以表征，將有助于解決當前設計生物電干預以實現特定結果的知識缺口。

在生物電領域也有類似現象的報道。利用基因編碼電壓指示器 rEstus 進行的熒光波動相關性分析表明，在永生化的 A375、HEK293T 和 MCF 細胞系中，Vmem 波動可以在細胞之間相互關聯，并且在融合細胞簇中 Vmem 變異性下降 [144]。我們所描述的事件比 Rühl 等人 [144] 所描述的波動更加離散；雖然我們在孤立細胞中觀察到空間變異性增加，但在群體中的細胞卻能穩定產生強健的數字信號。未來還需進一步研究，以確定我們報告的數字型生物電信號是否與 Rühl 等人描述的現象屬于同一機制，還是屬于不同的通路。

NCC 中數字型 Vmem 與鈣信號的比較

在 NCC 器官整體中，Vmem 與鈣信號是兩個基本獨立的信息通道，這與神經系統的范式存在顯著差異（圖8）。這種差異凸顯了在非神經細胞中使用鈣作為 Vmem 代理的風險，并強調了鈣非依賴性效應器在生物電信號中的重要性。Vmem 信號在比鈣信號更遠的距離上表現出互信息。這一模式有趣地與這兩種通道在神經元中的特化功能相吻合：Vmem 支持快速長距離通信，而鈣則介導囊泡釋放等局部過程。我們所觀察到的生物電信號的長距離特性，是否指向了一種后來被神經軸突取代的中介進化機制？深入理解 NCC 數字信號的機制起源，或將有助于揭示神經生物電的早期演化過程。

數字型生物電信號的分子基礎

超極化激活的環核苷酸門控通道（HCN）在超極化時增加膜陽離子傳導性，已被證明可介導 Xenopus 發育中化學和遺傳擾動的遠程修復 [46, 145, 146]。這些通道已在干細胞 [147–149]、包括神經元在內的興奮性細胞 [150] 和心肌細胞 [151, 152] 中被證實具有功能，因此它們很可能是我們描述的數字型生物電信號的潛在效應器。然而，HCN 通道對鈣具有通透性，而數字型生物電信號與鈣信號的相關性較弱。同樣地，盡管機械敏感的非特異性陽離子通道 Piezo1 對于正常 NCC 遷移至關重要 [69]，但它也會引發鈣內流，因此也不太可能是數字型生物電信號的效應器。因此，我們的數據指向另一種尚未明確的、受超極化激活的離子通道，能夠在大范圍內協調細胞生理狀態，這類通道將成為未來修復與再生研究的重要靶點。

關于生物電深層歷史的意義

將相對原始的 NCC 生物電回路與高度特化、標準化的動作電位回路進行比較，為我們窺探神經元特化過程的早期起源提供了誘人的視角。我們在此展示鈣信號與 Vmem 動態在神經嵴細胞中具有不同的計算能力，表明它們在深度進化過程中曾是與教科書中神經元中的角色截然不同的現象。也許正是這些電路整合過程中某些幸運的動力學巧合，點燃了神經元及其后續復雜性的演化火花？如果是這樣，那么通過定向工程其他生物回路，或許也能合成類似的非線性計算能力提升。進一步理解神經與非神經細胞中生物電碼的計算屬性與語義 [1, 2, 8, 53, 153–158]，將是構建生物學中行為與形態生成問題解決統一框架的基礎，也將開啟新型生物計算形式的潛力。

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