撰文 I 一只魚

Integrator（INT）是一種負(fù)責(zé)在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近終止RNA聚合酶II（RNAPII）轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)復(fù)合物，可以抑制應(yīng)激響應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄。INT亞基的突變與多種人類疾病相關(guān)，包括癌癥、纖毛病和神經(jīng)發(fā)育障礙，但I(xiàn)NT突變?nèi)绾螌?dǎo)致疾病尚不清楚。

近日，來自美國哈佛醫(yī)學(xué)院的Karen Adelman研究團(tuán)隊(duì)在Cell上發(fā)表題為Integrator loss leads to dsRNA formation that triggers the integrated stress response的文章，發(fā)現(xiàn)在人類細(xì)胞中，INT的功能喪失會誘導(dǎo)整合應(yīng)激反應(yīng)（ISR）。INT敲除導(dǎo)致短基因（如ISR轉(zhuǎn)錄因子ATF3）的上調(diào)。此外，INT敲除后逃逸進(jìn)入基因體區(qū)的未成熟RNAPII容易發(fā)生過早終止，產(chǎn)生含有保留內(nèi)含子的未完成前體mRNA。這些保留的內(nèi)含子中的逆轉(zhuǎn)錄元件形成雙鏈RNA（dsRNA），被蛋白激酶R（PKR）識別，進(jìn)而驅(qū)動ATF4的激活和持續(xù)的ISR。

INTS1是INT復(fù)合物在RNAPII暫停延伸復(fù)合物上的主要結(jié)合位點(diǎn)，研究人員首先利用CRISPR-Cas9構(gòu)建了INTS1AID細(xì)胞系，用生長素處理可以敲降INTS1的蛋白水平，發(fā)現(xiàn)INTS1敲降會導(dǎo)致所有INT亞基從SPT5/RNAPII復(fù)合物中解離。為了研究INT缺失對轉(zhuǎn)錄的直接影響，他們在生長素處理4小時后進(jìn)行了瞬時轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)在上調(diào)的基因中炎癥和應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)基因富集。INTS1缺失激活的基因長度顯著短于未受影響基因，下調(diào)基因則更長，而信號響應(yīng)基因通常長度較短，這可能有利于其快速激活。接下來他們分析了INTS1缺失4小時和12小時后的轉(zhuǎn)錄組，檢測到5個具有不同時序表達(dá)特征的基因簇，簇2-4顯著富集于促炎信號、DNA損傷及其他應(yīng)激反應(yīng)，值得注意的是，簇3基因在生長素處理4小時后僅輕微上調(diào)，但在12小時后激活程度顯著增強(qiáng)，這些基因與ATF3的表達(dá)呈最強(qiáng)關(guān)聯(lián)性。ATF3是整合應(yīng)激反應(yīng)（ISR）的核心調(diào)控因子，他們發(fā)現(xiàn)INTS1敲降細(xì)胞中ATF3和ATF4蛋白水平迅速升高并維持16小時，ISR通路基因表達(dá)顯著上調(diào)，eIF2α磷酸化，蛋白質(zhì)合成速率顯著降低，應(yīng)激顆粒形成。因此，破壞INT復(fù)合物可以激活I(lǐng)SR。

ISR可被多種應(yīng)激信號激活，包括未折疊蛋白、營養(yǎng)缺乏和雙鏈RNA（dsRNA），為了研究ISR激活的機(jī)制，他們對INTS1缺失12小時的細(xì)胞進(jìn)行RNA-seq基因集富集分析，排名最前的免疫響應(yīng)通路涉及細(xì)胞對dsRNA的反應(yīng)，他們推測INTS1缺失可能導(dǎo)致異常轉(zhuǎn)錄本合成，進(jìn)而產(chǎn)生dsRNA。通過免疫熒光檢測，他們發(fā)現(xiàn)敲降INTS1的4小時后細(xì)胞質(zhì)內(nèi)dsRNA信號顯著增加。細(xì)胞質(zhì)中的dsRNA被PKR識別后，會誘發(fā)其自磷酸化并磷酸化eIF2α，激活I(lǐng)SR，他們發(fā)現(xiàn)INTS1缺失后0-16小時磷酸化PKR水平迅速升高并持續(xù)維持。接下來他們敲除了PKR，發(fā)現(xiàn)可以抑制ISR的激活，因此，在INT缺失細(xì)胞中ISR的激活依賴于PKR。為了研究dsRNA的來源，他們利用結(jié)合dsRNA的J2抗體進(jìn)行RIP-seq，發(fā)現(xiàn)超過80%的J2與PKR RIP-seq峰與注釋TE區(qū)域重疊，其中短散在核元件（SINE）富集尤為顯著。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)INTS1缺失導(dǎo)致RNAPII延伸缺陷，在長基因中尤為顯著，這種缺陷促進(jìn)轉(zhuǎn)錄提前終止，釋放保留內(nèi)含子序列的前體mRNA，進(jìn)而形成dsRNA。

在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中描述最多的INT突變是INTS8，于是他們構(gòu)建了INTS8AID細(xì)胞系，首先驗(yàn)證了INTS8敲降可以破壞INT功能并引起細(xì)胞質(zhì)dsRNA累積，誘導(dǎo)ATF4翻譯、eIF2α磷酸化和PKR自磷酸化，激活I(lǐng)SR。此外，在兩例INTS8雜合突變患者的成纖維細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)ISR激活，并且將患者成纖維細(xì)胞重編程為iPSC后，通過CRISPR-Cas9進(jìn)行基因校正可以逆轉(zhuǎn)ISR的異常激活。

INT缺失誘導(dǎo)ISR的機(jī)制

總的來說，這項(xiàng)研究揭示了INT通過阻止未成熟RNAPII的異常逃逸，確保全長mRNA的正常合成。當(dāng)INT功能缺陷時，RNAPII成熟過程受阻導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄提前終止，dsRNA累積和ISR通路的持續(xù)激活。

原文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.cell.2025.03.025

制版人： 十一

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