摘要：評述了溶劑、載體性質與固載化方法、p H值、底物濃度以及反應溫度等因素對固載化酶催化合成肽反應的影響 , 并概括了固載化酶催化合成生物活性肽、寡肽等方面的研究與應用 .

關鍵詞： 固載化酶 酶催化反應 肽 親水性 疏水性

自1937年Bergmann與Conrat首次報道木瓜蛋白酶與α-胰凝乳蛋白酶催化合成肽以來, 蛋白酶催化合成肽的研究取得了許多成果. 酶法合成肽與化學法相比有許多優點, 如反應條件溫和、 消旋率小、 氨基酸側鏈常可不必保護和立體專一性強等 [1～6] . 在有機溶劑中酶可催化合成含非蛋白氨基酸的肽, 而基因重組方法卻無法實現 [7] . 但是, 自由酶催化合成肽時存在酶不能回收、 成本高、 不穩定、 易變性, 酶濃度高時會出現自溶現象和不易分離等缺點 [8] . 固載化酶不僅可以回收再用, 而且可提高酶的穩定性, 并簡化分離提純工藝, 可適合于多酶反應體系 [4, 8] . 固載化酶是指用物理或化學方法使酶不易隨水流失, 即運動受到限制, 并能發揮催化作用的酶制劑. 固載化酶主要有吸附、 包埋、 交聯和共價結合等方法 [9] . 固載化酶催化合成肽具有良好的發展前景, 特別是在工業應用上具有自由酶不可比擬的優越性. 因此固載化酶催化合成多肽的研究與應用引起了科學家們的重視. 目前, 酶法合成多肽比較有效的方法是采取熱力學控制的肽鍵形成, 即平衡合成; 或者采取動力學控制的肽鍵生成, 即非平衡合成. 熱力學控制的肽鍵生成, 反應速度慢, 關鍵在于通過控制某些影響化學平衡的因素, 如有機輔助溶劑、 反應溫度以及不溶性產物生成等, 使平衡向生成肽鍵方向移動. 對于動力學控制的肽鍵生成, 首先是N-保護的氨基酸酯與酶快速反應形成活潑的酰基化酶中間體, 然后此中間體迅速與親核試劑如氨基酸酰胺或氨基酸酯進行轉酯化反應生成肽. 水解反應是合成肽的競爭性副反應. 水解反應的強弱直接影響肽合成產率. 本文著重對固載化酶催化合成多肽的影響因素及其應用進行評述.

1 固載化酶催化合成多肽的影響因素

1.1 溶 劑

溶劑能以不同方式影響酶的催化反應. 它既可影響體系中水的分布, 從而影響酶的催化活性; 也可能影響底物與產物的分配, 或作為抑制劑直接影響酶的活性 [10] . 因此, 溶劑體系的選擇對固載化酶催化合成多肽十分重要. 文獻報道的固載化酶催化合成肽所用溶劑體系主要有3類, 分類如下.

1.1.1 水相體系

產物以沉淀形式析出, 促使平衡向肽鍵形成方向移動, 這是水相中酶促合成多肽的基礎. 固載化酶在水相中催化合成多肽存在許多不足之處, 如水解副反應競爭強烈; 酶用量相對較多; 產物易覆蓋在固載化酶周圍, 造成擴散限制, 因此在工業上應用受到限制. Haensler等 [11] 報道水解副反應可以通過冷凍反應體系得到抑制. 冷凍使反應液中部分液相變為固相, 液相減少, 反應物濃縮, 促使平衡向合成肽方向移動. 即使氨基組分不是一個有效的親核試劑, 經過冷凍反應也可得到較高的偶聯產率. 以Mal-Phe-OMe為?；w, H-Ala-Ala-OH為親核試劑, 殼聚糖共價固載化α-胰凝乳蛋白酶在25 ℃以及-10 ℃催化合成N-保護三肽Mal-Phe-Ala-Ala-OH, 產率分別為2%, 93%. 在水相中加入易溶的鹽 (如硫酸銨) 或其它水-有序試劑 (water-ordering agents) (如聚醇, 糖等) 也可以降低水解活性, 氨解反應與水解反應的速率比顯著增加, 從而提高產率 [12, 13] . 在含有1 mol/L的硫酸銨的硼酸緩沖溶液中, 用凝膠多點共價固載化胰蛋白酶催化Bz-Arg-OEt和Leu-NH2合成N-保護二肽酰胺Bz-Arg-Leu-NH4, 產率接近100%. 若不加硫酸銨, 產率約為82% [12] . 此外, 在水中加入兩種合適的水溶性高分子, 由于不同高分子的單體間存在排斥力而出現相-相分離, 從而形成雙相體系. 利用產物在兩相中的溶解度不同, 通過擴散, 也可促使平衡向肽鍵形成的方向移動. Kitano [14] 報道了共價結合在葡聚糖上的嗜熱桿菌蛋白酶在高分子水溶液兩相體系 (葡聚糖/水-聚乙二醇/水) 中催化合成甜味肽前體Boc-Asp-Phe-OMe的研究, 由于固載化酶主要分布在葡聚糖水相中, 而產物在聚乙二醇水相中的溶解度相對較大, 通過產物擴散, 平衡向肽鍵形成方向移動, 但產率較低 (40%) .

1.1.2 水-有機混合溶劑體系

在水中加入有機溶劑, 可增加疏水性底物和產物的溶解度, 而且還可抑制水解反應, 促使平衡向肽鍵形成方向移動, 從而使肽合成反應更有效地進行 [10] . 水-有機混合溶劑體系分兩類: 水-與水互溶的有機共溶劑體系和水-與水不互溶的有機混合溶劑體系. 前者中有機溶劑有較強的親水性, 如DMF、 乙腈、 THF、 丙酮、 甲醇和丁二醇等. 一般情況下, 肽收率在一定范圍內隨有機溶劑濃度的增加而增加. Wilson [15] 研究了DMF濃度對固載化Thermus strain Rt41A 蛋白酶催化合成Bz-Ala-Tyr-NH?的影響. 但發現肽的合成產率并不完全隨DMF濃度的增加而增加. 當DMF的濃度從10%增加到40%時, 肽的產率隨之降低. 隨后肽的產率出現一個相對平穩的階段. 當DMF的濃度增加到75%時, 肽的收率才開始增加. 分配常數P?的變化規律與之相反 (P?是影響水解與氨解速率常數的重要參數,P?=K? (H?O) /K?, K?為水解速率常數, K?為氨解速率常數, P?值愈大, 水解反應愈強烈) . 這表明只有當DMF的濃度達到一定程度時, 水解反應才受到抑制, 促使平衡向肽鍵形成的方向移動. 乙腈也有類似結果. Lozano等 [16] 報道與水互溶的非質子溶劑對硅藻土吸附固載化α-胰凝乳蛋白酶催化合成具有止痛活性的京都肽衍生物Bz-Tyr-Arg-OEt的影響. 結果發現, 在不同的水-與水互溶的有機共溶劑體系中, 有機溶劑的親水性愈強, 其最佳濃度愈大, 酶的催化活性愈高. 在所選用的5種與水互溶的非質子溶劑中, THF的疏水性相對較強, 最適有機溶劑濃度最小 (1.2 mol/L) , 酶的最大活性最小 (2.2 U/g 載體) ; DMSO親水性最強, 最適有機溶劑濃度最大 (5.7 mol/L) , 此時酶的活性最高 (10.8 U/g 載體) . 在水-與水不互溶的有機混合溶劑體系中有機溶劑屬疏水性溶劑, 如環己烷、 二氯甲烷等. 由于疏水性有機溶劑與水不互溶而形成雙相體系, 通過產物向有機相擴散, 促使平衡向肽鍵形成方向移動. 相對而言, 與水共溶的有機溶劑體系更易使酶失活. 酶在與水共溶的有機溶劑體系中與有機溶劑接觸面積大, 在雙相體系中與有機溶劑接觸面積小, 故酶在水-有機溶劑雙相體系中較穩定. 但是雙相體系在塔式操作中會出現溝流, 在工業應用上有一定難度 [17] .

1.1.3 有機溶劑體系

在有機溶劑中 [1, 5, 10] , 酶分子周圍需要很少量的水, 借以維持酶具有催化活性的必須構象, 這部分水稱作“必須水”. 有機溶劑中含水量較少, 水解副反應大大受到抑制, 因此有機溶劑有利于肽合成反應. 有機溶劑的親水性強弱直接影響酶的活性. 相對而言, 親水性有機溶劑容易剝奪酶分子表面的必須水, 從而使酶失活, 疏水性溶劑的效果較好. 溶劑疏水性強弱可用參數lgP來表征. P表示一種有機溶劑在正辛醇-水兩相溶液中的分配系數. 在一般情況下, lgP愈大, 疏水性愈強. lgP>4時, 反應介質有利于酶活性的提高, 是較理想的反應介質. lgP<2時, 有機溶劑極性太大易剝奪酶分子表面的必須水, 不宜于作酶促反應的介質. 2

最新研究結果表明, 有機溶劑體系也可以使用混合有機溶劑體系, 如乙腈與N, N-二甲基甲酰胺體系等 [18] . Levitsky 等 [19] 用3種不同載體 (硅藻土、 聚丙烯、 聚酰胺PA6) 分別吸附固載化糖基化 (glycated) α-胰凝乳蛋白酶在乙醇和與水不混溶的有機溶劑組成的混合有機溶劑體系 (乙酸乙酯、 叔丁醇、 氯仿、 甲苯、 正己烷和正癸烷) 中 (含水量3%) 催化合成N-保護的京都肽Z-Tyr-Arg-NH2, 結果發現, 在乙醇中加入疏水有機溶劑, 酶催化活性明顯提高, 其中以正己烷效果最好.

1.2 載體與固載化方法

固載化酶的載體應具有一定的親水性. 疏水性載體因缺少必須水而使固載化酶失活. 但是, 載體的親水性太強, 效果也不理想. 在低水含量有機溶劑中, 酶的必須水易被親水性強的載體剝奪, 使酶的活性降低. 在含水量較多的溶劑中, 親水性強的載體可能會使酶分子活性中心完全被水包圍, 酰化酶中間體易發生水解反應. ZHANG [20] 等報道, 4種載體 (硅藻土、 CM-纖維素、 QAE-葡聚糖凝膠A-25和自制的雞卵清蛋白) 用不同方法固載化木瓜蛋白酶在乙酸乙酯中催化合成N-保護二肽Boc-Phe-Val-OMe, 親水性低的載體雞卵清蛋白以及硅藻土的收率較好. 文獻[11]報道, 4種載體 (硅膠, Enzacryl AA, 殼聚糖, CM-纖維素) 共價固載化α-胰凝乳蛋白酶在冷凍水溶液中催化合成N-保護二肽Mal-Phe-AA-NH? (AA=Ala, Leu, Lys等) , 收率最低的是親水性強的載體Enzacryl AA. 載體孔徑與顆粒大小也可能對固載化酶催化反應產生影響. 控孔玻璃以及硅藻土共價固載化α-胰凝乳蛋白酶在循環反應器中催化合成N-保護的京都肽Z-Tyr-Arg-NH?, 孔徑小的載體有較大的P?值, 亦即水解反應速率較快, 產率較低; 而孔徑大的恰好相反 [21] . 孔徑小和顆粒較大的載體易產生較強的傳質限制 (mass transfer limitation) , 對?；w、 親核體選擇性以及立體選擇性都會產生一定的影響 [22] . 然而, XING等 [23] 報道了5種分子篩 (HY, NH?Y, NaY, HDDY, HNH?DAY) 吸附α-胰凝乳蛋白酶在有機溶劑中催化合成Z-TyrGlyGlyOEt的研究, 結果表明, Y型微孔分子篩比DAY型中孔分子篩的催化效果好, HY型分子篩固載化酶催化反應的收率最高 (78%) . 其主要原因可能是由于Y型分子篩帶有更多的負電荷以及OH官能團, 分子篩與酶之間的氫鍵作用較強, 使吸附于載體上的酶更穩定. 此外, 固載化酶的催化活性還受載體的酸堿性強弱的影響. XING等 [4] 利用4種分子篩 (HY, NH?Y, NaY, HNH?DAY) 吸附固載化嗜熱桿菌蛋白酶催化合成甜味肽前體Z-AspPheOMe, 結果與固載化α-胰凝乳蛋白酶不同. 在4種不同類型的分子篩中, HY型分子篩固載化酶催化效果最差, 產率低于10%, 其它的收率在60%～70%之間. 其原因是HY型分子篩有較強的酸性, 使反應液的pH值大大降低 (pH=3.32) (緩沖溶液的pH=6.98) , 超過嗜熱桿菌蛋白酶穩定的pH值范圍 (pH=6.0～9.0) , 從而導致固載化酶失活, 致使反應收率較低 [23] . 物理吸附固載化酶的活性損失較小,方法簡單, 易再生. 缺點是酶與載體結合不牢, 酶易從載體上脫落. 實驗中多采用吸附與其它方法相結合, 如吸附包埋、 吸附交聯. 酶在有機溶劑中不溶解, 因此吸附固載化酶在有機溶劑中進行催化反應比較有利 [17, 24] . 共價結合固載化酶比較牢固, 尤其是通過多點共價結合在高度活化載體上的酶的穩定性更強, 適合于工業應用上比較激烈的反應條件 [12] , 但在酶與載體進行共價結合的過程中, 酶活性損失較大. 共價結合固載化酶的載體有時需活化, 引入手臂, 避免由于載體的空間阻礙而造成底物分子難以與酶活性部位結合 [25] .

1.3 pH值

酶催化反應的最適pH值除與酶本身有關外, 還受親核底物的pK值、 緩沖液的離子強度和載體的帶電性質等因素影響. 在動力學控制肽合成中, 親核體進攻酰化酶中間體一般不帶電荷. 當溶液的pH值高于底物的pK?時, 親核底物的去質子化程度隨pH值的增加而增加. 非質子化的親核體濃度增加, 促使平衡向肽鍵形成方向移動, 并可得到較好的收率. 當pH值高于親核體pK?兩個單位時, 親核體會有98%去質子化. 然而pH值過高 (超過最佳值) , 產率可能由于[OH-]濃度增加而導致水解副反應的發生, 從而使產率降低 [15] . 在熱力學控制肽合成中, 最佳pH值相對較低. 這是因為當pH值增加時, 一方面, 親核體的非質子化形式的濃度增加; 另一方面, 當pH值達到某一個值時, 羧基組分的離子化程度會隨pH值的增加而增加. 兩者相互平衡的結果, 最佳pH值不可能太高 [12] . 然而, 上面僅為一般情況. Bemquerer等 [26] 利用固載化胃蛋白酶在乙酸乙酯中催化Z-Gly-Phe-OH與PheOMe·HCl合成Z-Gly-Phe-Phe-OMe, 當加入等物質的量的有機堿DIEA中和氨基組分時, 盡管非質子化形式的親核體濃度增加, 反應速率和產率均明顯降低, 但在乙腈中此現象不明顯. 其原因是乙酸乙酯 (含水量2%) 為疏水溶劑, 中和后的氨基組分被萃取到有機相, 酶活性部位及其周圍的親核組分的濃度大大降低, 致使反應速率和產率降低. 而乙腈 (含水量4%) 有較強的親水性, 堿的加入對氨基組分在有機相中的分配影響不大, 因而反應速率和產率基本上不受影響. Barros等 [27] 進行了硅藻土與聚酰胺吸附固載化α-胰凝乳蛋白酶催化AcPheOEt與AlaNH?·HCl合成N-保護二肽酰胺AcPheAlaNH?的研究. 結果發現, 當加入30 mmol親核試劑AlaNH?·HCl以及15～20 mmol Et3N時, 硅藻土固載化酶催化合成肽的活性明顯提高; 當加入Et?N (30 mmol) 時, 硅藻土固載化酶的催化活性反而降低. 而聚酰胺固載化酶不存在此現象. 其原因是硅藻土的孔徑相對較小, 吸附固載化酶的量較多時, 易發生傳質限制. 當加入Et?N的量為15～20 mmol時, 未被中和的質子化親核試劑將以分離的濃液相形式存在, 并與固載化酶緊密接觸. 分離的濃液相有較強的極性, 可以使部分酶從載體上脫落下來, 進入分離的濃液相中, 從而降低傳質限制. 另一方面, 分離的濃液相中親核試劑濃度較高, 有利于親核專一性的提高, 所以在此條件下硅藻土固載化酶催化合成肽的活性明顯增加, 而聚酰胺的孔徑較大, 不易發生物質擴散限制, 所以不存在此現象. Noritomi等 [24] 利用聚乙烯醇 (PVA) 固載化的α-胰凝乳蛋白酶在含少量水的乙腈中催化合成肽 (Ac-Tyr-Gly-NH?) , 發現pH值對反應幾乎無影響 (pH值范圍5～10) . 這可能是磷酸緩沖液對親核體產生影響的結果, 因為無緩沖液時pH值對反應影響比較大. 另外帶有電荷的載體也會影響最適pH值 [20, 23] . 陽離子交換樹脂會導致最適pH值偏低, 陰離子交換樹脂相反 [15] .

1.4 底物濃度

增加底物的濃度, 可以提高產率, 有時甚至可以達到定量轉化. 定量轉化可簡化分離提純的步驟. 然而并非所有情況都如此. 在熱力學控制肽合成時, ?；w的羧基為游離態, 過量加入可能導致pH值發生變化, 影響產率. 當底物的溶解性不好時, 過量加入會引起底物擴散限制 [28] . 高濃度底物還會使酶失活加快. Cramer等 [29] 利用固載化羧肽酶Y在批式攪拌反應器中催化合成肽Bz-Arg-Met-NH?, 當Bz-Arg-OEt的濃度為10 mmol/L, 親核體Met-NH?的濃度分別為50, 200 mmol/L時, 固載化羧肽酶Y在反應10 h后的活性分別為原來的98%, 85%; 當親核體Met-NH2的濃度為50 mmol/L, Bz-Arg-OEt的濃度分別為10, 50 mmol/L時,固載化羧肽酶Y在反應10 h后的活性分別為原來的98%, 80%. 此外, 當?；M分濃度達到飽和時, 增加其濃度對產率無影響 [12] .

1.5 溫 度

提高反應溫度通常會增加酶催化反應的速度, 但溫度過高會引起酶的變性失活, 反而降低肽產物的收率. 一些研究報道表明, 在低溫下酶促肽鍵生成有較好的收率. Nillson等 [4] 利用瓊脂固載化的α-胰凝乳蛋白酶在50%DMF溶液中催化合成肽Ac-Phe-Gly-NH?, 在22 ℃和-10 ℃時肽收率分別為67%, 86%. Blanco等 [13] 利用固載化胰蛋白酶 (Trypsin) 催化合成Bz-Arg-LeuNH?, 在4 ℃與37 ℃分別得到40%, 20%的產率. 可能由于亮酰胺吸附在胰蛋白酶的活性中心是一個疏水過程. 盡管溫度升高, 有利于疏水相互作用, 然而疏水相互作用在疏水吸附過程中是次要的因素, 主要影響因素是溶解在水中的亮酰胺的疏水部分以及被水包圍的胰蛋白酶的疏水亞基 (hydrophobic subsite) 溶劑化能的變化. 因為溫度升高有利于疏水化合物溶劑化, 整個疏水吸附過程在熱力學上是一個放熱過程, 所以溫度升高并不能增加反應產率.

此外, 酰基供體的結構以及保護基對固載化酶合成多肽也有影響. 硅藻土吸附固載化胃蛋白酶催化Z-AA-Phe-OH (AA=Ala, Asp, Glu, Gly, Phe, Ile, Val, Trp, Tyr) 與Phe-OMe形成相應的肽, 反應速率表明P?位置含有親水性取代基的羧基組分的反應速率較快, 與水相中的結果相反. 其原因是有機溶劑中疏水作用是次要的, 極性強的羧基組分在酶周圍水相中或活性部位的分配濃度較高 [26] . 固載化Aspergillus oryzae protease催化Boc-L-Tyr, Cbz-L-Tyr與Gly-NH?合成相應的N-保護二肽酰胺, 其產率分別為57.12%, 0.98% [7] , 在此反應中, 顯然保護基Boc比Cbz效果好.

2 固載化酶在肽合成中的應用

用自由酶催化合成多肽的酶均可以進行固載化并用于肽合成. 如嗜熱桿菌蛋白酶、 木瓜蛋白酶、 α-胰凝乳蛋白酶、 胰蛋白酶、 枯草桿菌蛋白酶、 胃蛋白酶、 羧肽酶Y等. 所合成的肽包括低熱值高甜度的甜味劑、 具有鎮痛作用的腦啡肽、 具有止痛作用的京都肽及其它生物活性肽等.

固載化嗜熱桿菌蛋白酶催化合成肽主要是甜味肽前體 (N-Z-L-Asp-L-Phe-OMe) 的合成, 收率較高. 例如, Oyama等 [30] 用載體Toyopearl共價固載化此酶在乙酸乙酯/水兩相體系中定量催化合成該前體, 并研究了不同手臂對固載化酶活性的影響; Nagayasu等 [31, 32] 用XAD-7吸附交聯固載化嗜熱桿菌蛋白酶在多種有機溶劑中進行了合成該前體的研究. 結果表明, 在含少量水的叔戊醇中固載化酶比在乙酸乙酯中有更好的反應活性與穩定性. 卓仁禧 [28] 和吳梧桐等 [33] 分別用多孔硅球、 海藻酸鈉固載化此酶在水相中也催化合成了該前體. 此外, Basso等 [34] 利用硅藻土 R-640 在甲苯中吸附制備固載化嗜熱桿菌蛋白酶, 以熱力學控制方法在甲苯中催化合成N-保護二肽Z-Phe-XX-P (XX-P: PheOEt, TyrOEt, LeuNH?) , 即使用等物質的量濃度進行反應, 也幾乎達到定量轉化. 這是由于反應過程中生成的水不斷的被載體硅藻土R-640吸收, 使反應體系保持足夠低的水活度 (a ?) , 水解反應受到抑制, 從而得到很高的收率. Amberlite XAD-7吸附交聯此酶在水-乙酸乙酯兩相體系以及乙酸乙酯單相中催化合成了N-Z-Phe-Phe-OMe (95%) . 經估算, 在兩相中、 30 ℃條件下, 此固載化酶在批式反應器中可重復操作1 100 h, 而活性僅喪失一半 [8] . WANG等 [35] 利用硅藻土吸附固載化木瓜蛋白酶, 在含少量水的乙酸乙酯中催化合成了亮-腦啡肽的前體N-保護二肽的酯Boc-Phe-Leu-OMe (90%) . ZHANG等 [20] 利用雞卵清蛋白共價固載化木瓜蛋白酶在乙酸乙酯中合成了亮-腦啡肽的前體N-保護三肽的酯Cbz-Tyr-Gly-Gly-OEt. Fite等 [36] 使用硅藻土與聚丙烯酰胺吸附固載化此酶催化合成了八肽膽囊素 (Cholecystokinin) 中的保護二肽片段: P-Gly-Trp-OBzl (P=PhAc and Mand) . 此外, 交聯的聚苯乙烯共價固載化木瓜蛋白酶在二氯甲烷與水的混合溶劑中催化合成了Boc-Val-Gly-OEt, Boc-Ala-Phe-OMe等肽酯, 產率中等 [24] . Enzacryl AA-Papain在磷酸鹽緩沖溶液 (含NaCl與EDTA) 中催化合成了Z-Arg-Ala-NH? [37] .

磺酸化作用可以增加生物分子的生物活性, 也能改變一些肽與小蛋白的折疊結構. 化學法引入磺酸官能團不具有選擇性, 伴隨較多副反應. Delhom等 [38] 利用瓊脂凝膠多點固載化芳基磺酸轉移酶 (Arylsulfotransferase) 選擇性地將對硝基苯酚磺酸的磺酸官能團轉移到含酪氨酸的生物活性肽的酪氨酸殘基上. 如LH-RH, Z-亮腦啡肽經固載化酶催化磺酸化后, 分別得到相應的產物: Pyr-His-Trp-Ser-Tyr (SO?H) -Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH? (98%) , Z-Tyr (SO?H) -Gly-Gly-Phe-Leu-OEt (95%) .

固載化α-胰凝乳蛋白酶在肽合成中的應用報道較多. 在親水有機溶劑中, α-胰凝乳蛋白酶催化合成N-保護二肽酰胺Ac-Tyr-Gly-NH?, 聚乙烯醇吸附固載化α-胰凝乳酶的催化產率比未固載化時大大增加 [24, 39] . 在50%DMF中, 高度活化瓊脂固載化此酶催化合成了Ac-Phe-Ala-NH? (97%) [4] . 在55%～60%的DMF中, 瓊脂固載化此酶催化合成了N-AcO-Phe-Leu-NH?, m-Cl-N-Bz-Phe-Leu-NH?, 但未得到o-Cl, p-Cl相應的產物. 其原因可能是此固載化酶的疏水口袋易與帶有負電荷的m-Cl?；o體結合 [40] . Afrin 等 [41] 利用特氟隆 (polytetrafluoro-ethylene) 包埋固載化α-胰凝乳蛋白酶催化合成了Ac-Phe-Ala-NH?, 但由于特氟隆是疏水性載體, 產率較低.

用固載化酶Enzacryl AA-Trypsin催化合成了Z-Lys-Leu-NH?, 產率中等. 纖維素固載化胰蛋白酶催化Bz-Gly-Lys-OH 與HCl·Leu-OMe合成了Bz-Gly-Lys-Leu-OMe (93%) , 而且還催化豬胰島素去丙氨酸B鏈 (30B-deAla) 與蘇氨酸叔丁酯合成了人胰島素叔丁酯 (70%) [37] .

Bacheva等 [18] 利用PVA-cryogel 固載化枯草桿菌蛋白酶在不同比例的乙腈與N, N-二甲基甲酰胺混合溶劑中催化Z-Ala-Ala-LeuOCH?和Phe-pNA合成了四肽衍生物Z-Ala-Ala-Leu-Phe-pNA, 并發現Z-Ala-Ala-LeuOH, Z-Ala-Ala-LysOH和Z-Ala-Ala-GluOH等也是此固載化酶的合適底物. 熱力學與動力學控制方法合成肽的收率差別不大 (約85%) , 并已用于規?；a.

化學修飾可使固載化酶的專一性發生改變. 固載化嗜熱桿菌蛋白酶的Tyr110經Ac-Phe-OSu?；? 催化鏈短的?；孜锖铣呻幕蛩傻碾乃獾幕钚栽黾? 與?；跋啾? 其催化合成與水解二肽Fua-Gly-Leu-NH?和Fua-Gly-Phe-NH? (Fua=N- ([3- (2-furyl) acryloyl]amino acid) 的活性均增加約3倍, 但對合成二肽Fua-Phe-Leu-NH?和Fua-Phe-Phe-NH?的活性未發生改變, 水解活性明顯降低. 由此可見, 經?；? 酶的專一性變寬 [42] . 從酵母菌中制得的羧肽酶Y具有較寬的專一性. 在酸性條件下具有外切肽酶的活性, 而在堿性條件下又是一個有效的酯酶. 固載化羧肽酶Y可用于脫除肽C-端的α-酯官能團, 而側鏈的羧基 (如谷氨酸、 天門冬氨酸) 以及C端D-型氨基酸的α-羧基所形成的酯卻不受影響 [43] . 固載化羧肽酶Y在S'? (Met?3??) 位經苯甲酰溴修飾后, 有較強的?；富钚? 可用于肽C端的酰胺去酰化, 且比較穩定. 在脫除肽C-端的α酯基或去?；臈l件下, 它們所表現出來的肽酶活性可以忽略不計. 固載化羧肽酶Y若用汞化物 (PhHgCl) 修飾, 催化肽合成的選擇性增強, 但不穩定. 固載化羧肽酶Y以及PhHgCl修飾后的固載化羧肽酶Y催化Bz-Ala-OMe與Val-OMe合成Bz-Ala-Val-OMe, 結果是前者有較多的副產物Bz-Ala和Bz-Ala-Val. 而后者幾乎沒有副產物Bz-Ala-Val. 固載化羧肽酶Y經苯甲酰溴或汞化物 (PhHgCl) 修飾, 選擇性增強, 其原因是在S'?引入苯基, 導致S'?位有較大的立體位阻 [44] . 經化學修飾的固載化酶更適合于催化合成某些肽的反應. 合成肽的親核組分可以是氨基酸、 氨基酸烷基酯或氨基酸酰胺, 氨基酸親核效果不好, 產率較低. 氨基酸烷基酯作為親核體, 固載化羧肽酶Y催化反應時易發生寡聚生成寡聚氨基酸, 不易控制. 氨基酸酰胺不會出現寡聚, 且收率較好 (60%～95%) . Cramer等 [44, 29] 利用汞化物修飾的固載化羧肽酶Y的肽酶活性及苯甲酰溴?；墓梯d化羧肽酶Y的?；富钚? 以氨基酸酰胺為親核體, 經過多次肽偶聯-肽酰胺的去?；?羧基甲酯化, 逐步合成了N-Bz-Arg-Met-NH?, N-Bz-Arg-Met-Leu-NH?及N-Bz-Arg-Met-Leu-Phe-NH?. 最后一個產物是合成N-保護三肽N-Formyl-Met-Leu-Phe的中間體.

此外, 部分固載化酶已用于反應器中催化合成肽. 固載化嗜熱桿菌蛋白酶、 木瓜酶以及α-胰凝乳蛋白酶在乙酸乙酯中合成了一些含必須氨基酸的肽, 如Z-Lys (Z) -Ile-OMe, Z-Leu-Phe-OMe和Boc-His (Tos) -Val-OEt等, 產率較高 [45] . 固載化嗜熱桿菌蛋白酶、 α-胰凝乳蛋白酶在乙酸乙酯中通過連續縮合與轉酯反應催化Z-Gly, PheOMe與LeuNH?合成了三肽Z-Gly-Phe-LeuNH?. 在塞流式反應器中連續操作220 h, 產率在80%以上, 而固載化嗜熱桿菌蛋白酶、 α-胰凝乳蛋白酶的活性基本保持不變, 分別為原來的94%, 100% [46] .

3 結 語

固載化酶催化合成多肽的研究方興未艾. 其發展歷史相對較短, 機遇與挑戰并存. 預計今后的研究主要有3個方面: (1) 遴選與開發合適的、 新的載體. 用于固載化酶的載體需具有一定的親水性與機械強度, 使固載化酶保持較高的活性, 可多次重復使用. 固載化酶重復使用的次數多少對其在工業上的應用有重要的影響. 此外, 還需考慮載體來源及價格等因素. (2) 固載化酶方法的研究. 固載化酶的方法較多, 如吸附、 交聯、 共價偶聯等. 從已有的報道來看, 共價固載化酶催化合成肽的研究相對較少, 尚待發展, 主要是由于共價固載化酶活性損失較大所致. 然而, 共價固載化酶有其自身的優點: 酶與載體結合牢固, 可多次重復使用, 而酶一般不會從載體上脫落下來. 若能選用合適的偶聯試劑與載體, 使共價固載化酶有較高的固載化效率及催化活性, 則其應用, 尤其是工業上的應用前景廣泛. (3) 篩選新菌種, 挑選新的酶源, 增加固載化酶的數量, 拓寬固載化酶催化合成肽反應的范圍.

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