流感病毒是全球性的公共衛生問題，它不僅會導致季節性流感，還會引發偶發的大流行，給人類健康帶來嚴重威脅。歷史上多次流感大流行造成了數以百萬計的死亡，例如 1918年大流行就導致了約5000萬人死亡。此外，季節性流感每年也會導致29萬至65萬人死亡。由于流感病毒的包膜蛋白具有高突變率，現有的疫苗無法有效預防新出現的病毒株。目前主流的抗流感藥物主要針對病毒的包膜蛋白，但抗藥性問題日益嚴重。近年來，雖然有新的抗病毒藥物如瑪巴洛沙韋獲批，但耐藥病毒株也迅速出現。因此，開發新的廣譜流感疫苗和抗病毒藥物迫在眉睫。

流感病毒屬于正黏病毒科，是一種分節段的負義單鏈 RNA病毒。其基因組包含7或8個RNA片段，每個片段編碼至少一種病毒蛋白。病毒的核糖核蛋白復合物（RNP）由病毒基因組RNA片段、多個核蛋白（NP）亞基和聚合酶復合物組成，負責在宿主細胞中執行病毒基因組的轉錄和復制。與包膜蛋白相比，NP和聚合酶復合物在進化上更為保守，因此被認為是開發抗病毒藥物的理想靶點。然而，由于RNP的結構復雜且具有高度柔性，其高分辨率結構分析一直是一個挑戰。

美國賓夕法尼亞州立大學 Yi-Wei Chang 通過結合冷凍電鏡單顆粒分析（ SPA）和冷凍電子斷層掃描（cryo-ET）技術，揭示了流感RNP的高分辨率結構，并提出了流感病毒復制過程中RNP如何維持其雙螺旋結構的同時進行RNA合成的機制。此外，研究還通過虛擬篩選發現了針對RNP的潛在抗流感藥物先導化合物。 相關內容以“ Molecular basis of influenza ribonucleoprotein complex assembly and processive RNA synthesis ”為題發表在《

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【核心結果】

RNP結構解析： 通過SPA技術，研究者們發現流感D病毒的RNP呈現出右手、反平行的雙螺旋結構，NP亞基通過尾環連接，RNA被封裝在雙螺旋的小溝中。通過STA技術，研究者們進一步確認了這一結構，并觀察到RNP在不同功能狀態下呈現出多種不同的構象，表明雙螺旋內部存在動態的鏈間運動。

聚合酶復合物的可視化： 研究者們在 RNP的預啟動和延伸狀態下可視化了聚合酶復合物，發現聚合酶始終與RNP的外表面相關聯，支持了一種螺旋鏈滑動模型，即聚合酶沿著RNA模板進行RNA合成，同時保持RNP的整體雙螺旋結構。

抗流感藥物先導化合物的發現： 通過虛擬篩選，研究者們針對 NP的尾環結合界面識別出了一些先導化合物，這些化合物在細胞實驗中有效抑制了流感病毒的復制。

【主要內容】

圖1流感D病毒NS段RNP的體外重組與純化

圖中 展示了流感 D病毒NS段RNP的重組過程。通過共轉染NP、聚合酶亞基和NS RNA片段到HEK293T細胞中，利用串聯親和純化技術分離出完整的RNP復合物。重組的RNP呈現桿狀結構，長度主要集中在35-45 nm，比長RNP更剛性。實驗還證實了重組RNP的活性，檢測到病毒RNA（vRNA）和互補RNA（cRNA），其中vRNA含量遠高于cRNA，與病毒感染細胞中的情況類似。此外，觀察到聚合酶在RNP復合物中的不同位置，表明其可能處于啟動、終止或延伸狀態。

圖2流感D病毒NS段RNP的雙螺旋結構

通過冷凍電鏡單顆粒分析（ SPA）解析了流感D病毒NS段RNP的高分辨率結構。結果顯示RNP為右手、反平行的雙螺旋結構，NP亞基通過尾環連接，病毒RNA被封裝在雙螺旋的小溝中。每個NP亞基可容納約20個核苷酸，RNA結合槽高度帶正電荷，有利于RNA的結合。此外，還觀察到NP亞基之間的開放口袋，可能允許RNA的二級結構伸出RNP。

圖3流感A病毒天然RNP的構象景觀

利用冷凍電子斷層掃描（ cryo-ET）和子斷層平均法（STA）分析了流感A病毒天然RNP的結構。結果顯示RNP為右手雙螺旋結構，與重組RNP類似，但天然RNP更伸展，展現出更高的動態性。NP亞基在雙螺旋中可以沿軸向和垂直于軸向自由旋轉，導致相鄰NP亞基之間的距離和小溝的寬度沿螺旋路徑變化，這種動態性可能有助于RNP在RNA合成過程中的鏈間滑動。

圖4流感D病毒NS段RNP聚合酶端的結構

通過冷凍電子斷層掃描（ cryo-ET）和子斷層平均法（STA）解析了流感D病毒NS段RNP聚合酶端的結構。結果顯示聚合酶位于RNP末端，與末端NP亞基之間存在約12-18 ?的間隙，表明聚合酶與NP之間的相互作用可能是靈活的或瞬時的。聚合酶的結合需要至少15-20個核苷酸的RNA片段來連接末端NP亞基和聚合酶中的RNA末端。

圖5流感D病毒NS段RNP在RNA延伸過程中的結構

通過冷凍電子斷層掃描（ cryo-ET）和子斷層平均法（STA）解析了流感D病毒NS段RNP在RNA延伸過程中的結構。結果顯示聚合酶位于RNP中間，與兩個末端NP亞基相互作用。聚合酶從雙螺旋的一側讀取RNA模板，而另一側的NP亞基則通過局部構象變化（“服務構象”）釋放RNA，使其可供聚合酶使用。這種機制允許聚合酶在RNP的一條鏈上保持靜止，而在另一條鏈上移動，從而實現雙螺旋鏈之間的滑動。

圖6針對NP尾環結合界面的抑制劑設計

基于 NP尾環結合界面的結構特征，設計并篩選了針對該界面的抑制劑。通過虛擬篩選和表面等離子共振（SPR）實驗，識別出三種候選化合物（化合物1、5和23），它們對單體NP具有良好的結合親和力，而對三聚體NP的結合較弱。這些化合物在細胞實驗中顯示出對流感A病毒復制的抑制作用，其中化合物1和5的抑制效果較好，且在低濃度下無明顯細胞毒性。

【全文總結】

本文通過結合冷凍電鏡單顆粒分析（ SPA）和冷凍電子斷層掃描（cryo-ET）技術，揭示了流感病毒核糖核蛋白復合物（RNP）的高分辨率結構及其在RNA合成過程中的動態機制。研究發現，流感RNP呈現為右手、反平行的雙螺旋結構，病毒RNA被封裝在雙螺旋的小溝中，相鄰的核蛋白（NP）亞基通過尾環相互連接。聚合酶復合物在RNP的外表面與雙螺旋結構相互作用，通過鏈間滑動模型沿著RNA模板進行RNA合成，同時保持RNP的整體雙螺旋架構。此外，研究還通過虛擬篩選發現了針對NP尾環結合界面的潛在抗流感藥物先導化合物，這些化合 物在細胞實驗中有效抑制了流感病毒的復制。這些發現不僅增進了我們對流感病毒復制機制的理解，還為開發下一代廣譜抗流感治療藥物提供了重要的結構基礎和潛在的藥物靶點。

本期編輯：Double

本文來源：BioMed科技公眾號