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探索免疫耐藥難題，提供臨床診療新思路。

一篇題為《CRKL通過介導肝細胞癌中腫瘤相關中性粒細胞浸潤導致對PD-1抑制劑的耐藥性》(IF:26.8)[1]，發表于《

Journal of Hepatology

圖1 研究概述圖

研究背景

HCC是全球癌癥相關死亡的第三大原因，盡管HCC治療療效已有顯著改善，但大多數HCC患者就診時已為中晚期，喪失手術切除機會。免疫檢查點抑制劑（ICIs）的出現為腫瘤治療帶來了翻天覆地的變化，在肝癌領域，根據Ⅲ期臨床試驗IMBrave150的積極結果，阿替利珠單抗聯合貝伐珠單抗已成為晚期HCC患者一線標準療法之一。然而，其他針對HCC患者的抗PD-1療法的隨機臨床試驗（KEYNOTE-240和CheckMate-459）并未顯示出療效的顯著改善，這表明可能存在某種機制塑造了HCC復雜的免疫抑制微環境，進而導致患者對PD-1療法產生耐藥性。因此，需要進一步探索生物標志物以優化患者治療選擇并克服免疫治療耐藥性。

中性粒細胞是人體中最豐富的循環白細胞，并在多種癌癥類型中積聚。腫瘤中的中性粒細胞表現出顯著的可塑性，并且已被證明能夠在T細胞炎癥微環境中獲得抑制T細胞的能力。中性粒細胞通過釋放抗腫瘤因子如TSP-1和過氧化氫，可能表現出抗腫瘤效應，抑制腫瘤進展，并在免疫治療后獲得抗腫瘤表型。腫瘤相關中性粒細胞（TANs）在多種實體瘤中具有促進腫瘤的作用，強調了TANs在塑造免疫抑制性腫瘤微環境（TME）和免疫治療耐藥性中的關鍵作用。CRKL是一種位于人類22q11.21染色體上的適配器蛋白，參與多種生物學過程。CRKL在多種癌中表達升高，且其擴增可驅動癌變和表皮生長因子受體抑制劑耐藥性。因此，該研究探索了CRKL在HCC中對抗PD-1耐藥性中的潛在作用。

研究方法

患者與樣本

• 隊列1：納入2019年8月至2021年12月在上海復旦大學附屬中山醫院接受抗PD-1治療的32名不可切除HCC患者的32例標本。依據mRECIST標準，部分緩解（PR）指靶病灶最長直徑總和至少減少30%，疾病進展（PD）指靶病灶最長直徑總和至少增加20%且絕對增加至少5毫米。通過MRI評估治療療效，并對5名反應者和5名非反應者的治療后HCC組織進行RNA測序。

• 隊列2：隨機選取2019年6月至2021年3月在復旦大學附屬中山醫院接受根治性切除術的35名HCC患者的標本，用于測量CRKL蛋白表達及CRKL、β-catenin、VEGFa和CXCL1表達的相關性。該部分研究獲得倫理委員會批準，患者均簽署知情同意書。

• 隊列3和隊列4：包含342例HCC樣本（TMA1，隊列3）和62例HCC樣本（TMA2，隊列4）。隊列3患者接受根治性切除術的時間為2002年5月至2006年12月，用于生存分析；隊列4患者接受根治性切除術的時間為2010年3月至2013年11月，樣本用于免疫組化染色。所有患者均簽署知情同意書，研究遵循相關倫理標準。

研究設計： 通過RNA測序和遺傳篩選確定CRKL作為抗PD-1耐藥基因。在小鼠模型中，通過長期藥理治療建立抗PD-1單克隆抗體治療的耐藥模型，并收集耐藥腫瘤組織進行RNA分析。研究還納入了32名接受抗PD-1治療的不可切除HCC患者，評估治療效果，并對治療中的腫瘤組織進行測序 。

統計分析： 使用GraphPadPrism8或R（v.4.0.2）進行統計分析，采用Student’st檢驗比較兩組差異，ANOVA比較多組差異，Kaplan-Meier方法和log-rank檢驗用于生存分析，Pearson相關性分析用于變量間相關性分析。

研究結果

研究通過對耐藥腫瘤組織進行RNA測序和遺傳篩選，發現CRKL在抗PD-1耐藥腫瘤組織中顯著上調。在32名接受抗PD-1治療的HCC患者中，進一步驗證了這一結果，發現CRKL在非應答者中的表達高于應答者，且CD8+T細胞浸潤減少（圖2），表明CRKL可能是影響抗PD-1治療效果的關鍵因素。

圖2

為了探討CRKL在HCC中的預后意義，研究分析了HCC樣本中CRKL的表達情況，發現CRKL表達顯著升高，且高表達與患者預后不良相關（圖3）。進一步分析顯示，CRKL高表達與腫瘤大小較大和疾病晚期相關（圖4），且是患者術后總生存期和無復發生存期的獨立預測因子，這強調了CRKL作為生物標志物在HCC臨床治療中的潛在價值。

圖3

圖4

另外，研究發現CRKL過表達顯著降低了抗PD-1治療的效果，并抑制了CD8+T細胞的浸潤。在免疫健全小鼠模型中，與對照組相比，CRKL過表達組的腫瘤生長未受到抗PD-1單克隆抗體的顯著抑制，且腫瘤組織中CD8+T細胞的數量和活性均顯著減少，揭示了CRKL在塑造免疫抑制腫瘤微環境中的作用。

進一步的機制研究發現，CRKL過表達通過招募腫TANs改變了腫瘤免疫景觀。在CRKL過表達的小鼠模型中，腫瘤浸潤性中性粒細胞數量顯著增加，而CD8+T細胞數量減少（圖5）。特別是PD-L1+TANs在CRKL過表達腫瘤組織中顯著上調，這些TANs通過表達PD-L1抑制T細胞活性，從而促進腫瘤免疫逃逸。

圖5

研究還提示，VEGFα和CXCL1是CRKL誘導TANs浸潤的關鍵因子。CRKL過表達的HCC細胞通過上調VEGFα和CXCL1的表達，促進了TANs的遷移和激活。使用VEGFα抑制劑貝伐珠單抗和CXCR2/1抑制劑SX-517可有效阻斷CRKL過表達誘導的TANs遷移，表明VEGFα和CXCL1在CRKL誘導的TANs浸潤中發揮著至關重要的作用。

總之，這一研究揭示了CRKL通過與β-catenin直接相互作用來調控VEGFα和CXCL1的表達。CRKL過表達增強了β-catenin的蛋白水平和活性，而CRKL敲除則降低了β-catenin的蛋白水平和活性。這種相互作用抑制了APC介導的β-catenin泛素化降解，從而促進了VEGFα和CXCL1的表達，為CRKL在HCC中促進腫瘤進展和免疫逃逸的分子機制提供了新的思路。

研究結論和意義

該研究揭示了CRKL在HCC中對抗PD-1治療耐藥性中的關鍵作用，闡明了CRKL通過β-catenin/VEGFα和CXCL1信號通路調控TANs浸潤，導致免疫抑制腫瘤微環境和抗PD-1耐藥性的機制。研究結果支持貝伐珠單抗為基礎的免疫檢查點抑制劑聯合治療策略，并提示CRKL抑制劑聯合抗PD-1治療可能成為HCC治療的新選擇。

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參考文獻：

[1]Xie P, Yu M, Zhang B, et al. CRKL dictates anti-PD-1 resistance by mediating tumor-associated neutrophil infiltration in hepatocellular carcinoma. J Hepatol. 2024 Jul;81(1):93-107.

審批號：CN-160460 有效期至：2026-05-21

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