傳統醬香型白酒的釀造工藝復雜，歷時一年的生產過程需歷經2 次投料、9 次蒸煮、8 次發酵及7 次蒸餾取酒，而每個輪次發酵過程均需將糟醅攤涼并拌入不可或缺的糖化發酵劑——高溫大曲，曲料比例高達1∶1，因此，高溫大曲對于醬香型白酒獨特的醬香風格特征的形成至關重要。

曲乃酒之骨。作為醬香型白酒生產過程重要糖化劑和發酵劑的高溫大曲，由小麥等谷物經制坯、發酵、貯存等工藝過程制備而成。許多研究證實，醬香型白酒主體醬香風味與高溫大曲的生物學特性間關系十分密切。

傳統高溫大曲的制造過程主要包括成型、發酵、成熟3 個過程。一般地，在高溫大曲制備工藝過程中，溫度的變化以及酸度、醇、微生物代謝產物等的增減均會改變曲塊微生物發酵的環境條件，進而構建形成獨特的微生物群落結構及豐富的酶系統，影響基酒的風味品質。與白酒釀造過程中的翻堆類似，大曲制備過程的兩次翻倉操作必然會顯著改變曲房內曲塊的溫濕度等發酵參數，進而影響曲塊內微生物群落演替和代謝活動。

北京工商大學食品與健康學院的丁澤、陳曦、李秀婷*等采用高通量測序結合氣相色譜-質譜（GC-MS）聯用技術對醬香型高溫大曲制備過程中翻倉操作前后的微生物群落結構組成以及揮發性風味物質等進行探究，進一步分析翻倉操作前后微生物群落結構與揮發性成分之間的相關性變化，揭示大曲制備過程中微生物群落組成以及演替規律，闡釋大曲內微生物群落的潛在功能并解析釀造白酒重要風味物質的形成根源，以期為實際生產提供基礎數據與理論指導。

1 翻倉操作前后大曲微生物群落多樣性分析

1.1 測序有效性分析

為探索翻倉操作對于大曲制造過程中曲塊內微生物群落結構的影響，采用高通量測序技術分析E1、E7、E14、E46大曲樣品中的微生物組成。為便于分析，在除去低質量序列、嵌合序列和PCR引物后，將序列相似性在97%以上的水平歸為同一分類操作單元（OTU），最終獲得具有117 個細菌OTU和316 個真菌OTU的有效序列。Shannon指數稀釋曲線逐漸趨于平穩，表明測序深度足以滿足后續分析，并且從足夠的數據量中捕獲了大部分系統型（圖1）。

1.2

表1列出了微生物群落的α多樣性指數，包括物種豐富度（Chao1和ACE）、多樣性（Shannon和Simpson）和覆蓋率。所有樣本的覆蓋率均為99.9%，表明本實驗的測序結果可以較為真實地反映各樣品中的細菌和真菌等微生物的多樣性，測序結果的有效性較高。在發酵的前7 d，曲塊內真菌群落的Shannon和Chao1指數顯著降低，而細菌群落的Chao1指數也顯著降低，Shannon指數同樣表現出降下降趨勢。發酵7～14 d，真菌群落的Chao1指數有些許提高，但Shannon指數繼續降低；細菌群落的Shannon和Chao1指數則有所提高。發酵14～46 d，大曲曲塊真菌群落的Shannon指數和Chao1指數再次升高，細菌群落Shannon指數降低，Chao1指數提高。此分析結果表明，處于發酵階段的大曲隨著曲塊溫度的升高曲塊內微生物多樣性降低；在兩次翻倉操作期間，細菌群落的Shannon指數保持相對穩定，而真菌群落的Shannon指數顯著降低，表明大曲發酵過程中曲塊內真菌的多樣性受發酵環境的影響更為劇烈。

1.3

基于OTU水平Bray Curtis距離的主坐標對各樣品微生物群落結構相似度進行評價以評估β多樣性，由圖2可知，真菌和細菌群落結構兩主坐標差異解釋度累計方差貢獻率分別為63.85%和80.59%（＞50%），能夠可靠反映樣品中絕大部分信息。β多樣性分析顯示，在翻倉操作前后的曲塊樣品中的微生物群落具有明顯的聚類。翻倉操作前后的大曲在PCo1軸上相隔距離較遠，說明微生物群落結構主要受PCo1影響，大曲制造過程中翻倉操作前后的菌群組成差異顯著。

2 翻倉操作前后大曲微生物群落組成分析

基于翻倉操作前后的樣品繪制了Venn圖以判斷是否存在僅在部分樣本中特有或共享的OTU。如圖3所示，樣品中共檢測到細菌OTU 117 個，其中E1、E7、E14、E46的樣品中檢出細菌OTU數量分別為96、38、67、78 個。同時，樣品中共檢出真菌OTU 316 個，E1、E7、E14、E46的樣品中檢出細菌OTU數量分別為222、31、46、221 個。E1和E46的樣品中的真菌和細菌OTU數量遠高于其他大曲樣品，第一次翻倉的樣品最低。結果表明，在這4 個樣本中有32 個共有的細菌OTU和19 個共有的真菌OTU。E1中的獨立細菌OTU數量最高，E1和E46中的獨立真菌OTU數量較高。由此可知，E1含有一系列具有相對高豐度的獨特細菌物種和真菌物種，而兩次的翻倉操作導致大曲中獨特細菌物種和真菌物種的豐度降低，在翻倉之后隨著繼續發酵大曲中獨特細菌物種和真菌物種的豐度回升。這些結果表明，翻倉操作會導致大曲曲塊內細菌和真菌群落多樣性以及豐富度發生明顯變化。

為明確大曲制造過程不同階段的微生物群落組成，從門和屬水平對大曲樣品進行了分析。圖4A、B展示了不同階段大曲在真菌門和屬水平上的變化。在真菌門水平上，子囊菌門（Ascomycota）、毛霉門（Mucoromycota）、擔子菌門（Basidiomycotad）的豐度較高，在不同樣品中它們的相對豐度之和接近100%。在屬水平上，共檢測到139 個屬，其中14 個屬的相對豐度大于1%，占總真菌群落的94.31%～97.79%。在大曲制造初期（E1），曲霉屬（Aspergillus）、根霉屬（Rhizopus）、根毛霉屬（Rhizomucor）、交鏈孢屬（Alternaria）、unclassified_o_Saccharomycetales為優勢菌屬，熱子囊菌屬（Thermoascus）、嗜熱真菌屬（Thermomyces）、紅曲霉屬（Monascus）、畢赤酵母屬（Pichia）、絲衣霉屬（Byssochlamys）、節擔菌屬（Wallemia）、附球菌屬（Epicoccum）、異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces）、Apiotrichum為次優勢菌屬，其他屬為稀有菌屬。

在E1中Thermoascus和Thermomyces的相對豐度較低，僅為1.49%和1.77%，而經歷兩次翻倉操作之后Thermoascus的相對豐度分別增加到31.22%和70.96%，Thermomyces的相對豐度分別增加到16.18%和28.52%。在E46中Thermoascus的相對豐度回落至25.76%，Thermomyces的相對豐度回落至15.50%。它們能夠適應大曲曲塊堆積發酵產生的較高溫度，從而在E7和E14中相對豐度上升，而在E46中隨著曲塊溫度的降低，它們的豐度也有所降低。趙慧君等對濱州地區高溫和中溫大曲的真菌群落組成研究發現，Thermoascus和Thermomyces是高溫大曲中的優勢菌屬，并且在高溫大曲中的平均相對含量高于中溫大曲；與本研究結果一致，進一步證實了高溫環境對這些菌屬生長的促進作用。Monascu是在白酒發酵中起關鍵作用的一類真菌，其在E1中的相對豐度僅有0.11%，樣品E7中增加到43.72%，而隨著發酵的進行在E46中降低到0.28%。另外，在E1中，unclassified_o_Saccharomycetales、Aspergillus、Rhizopus、Pichia、Rhizomucor的相對豐度較高，分別為22.54%、11.00%、19.43%、6.79%、13.27%，在群落中占優勢。但隨著兩次翻倉的進行，它們的相對豐度也逐漸下降，在E7和E14中成為稀有菌屬。而在發酵46 d后，unclassified_o_Saccharomycetales、Aspergillus、Rhizopus、Pichia相對豐度回升至24.34%、6.69%、6.48%、10.92%，重新在群落中占據優勢。

圖4C、D展示了不同階段大曲在細菌門和屬水平上的變化。在細菌門水平上，厚壁菌門（Firmicutes）、藍藻門（Cyanobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）和變形菌門（Proteobacteria）為優勢菌門。Firmicutes是最主要的優勢細菌門，在E1、E7、E14、E46中分別占總豐度的87.90%、89.32%、95.72%、94.03%。Actinobacteria在大曲制造過程中的豐度總體呈現先上升后下降的趨勢，在E7中的相對豐度（10.66%）最高。而Proteobacteria和Cyanobacteria則呈現相反的趨勢，在E1中豐度最高，經歷兩次翻倉在E7和E14中豐度降到最低，在E46中豐度回升。在細菌屬水平上，共檢測到69 個屬，其中優勢屬有12 個，占細菌群落總數的93.53%～99.96%。盡管不同階段的大曲樣品中的細菌群落差距較大，但總體來看，芽孢桿菌屬（Bacillus）、枝芽孢菌屬（Virgibacillus）、火山渣芽孢桿菌屬（Scopulibacillus）、海洋芽孢桿菌屬（Oceanobacillus）、糖多孢菌屬（Saccharopolyspora）、克羅彭斯特菌屬（Kroppenstedtia）是優勢菌屬（平均相對豐度大于10%），葡萄球菌屬（Staphylococcus）、片球菌屬（Pediococcus）、考薩考氏菌屬（Kosakonia）、unclassified_o_Chloroplast、魏斯氏菌屬（Weissella）、高溫放線菌屬（Thermoactinomyces）是次優勢菌屬（平均相對豐度在10%～1%之間）。

在E1中Bacillus的相對豐度為60.64%，在兩次翻倉過程中其相對豐度有所降低，而隨著后續的發酵其相對豐度逐漸增長，在E46中達到69.29%。Huang Ping等對不同生產模式制作過程中的大曲細菌群落組成研究發現，Bacillus是酒曲制造過程中最主要的細菌屬，并且在制造過程中溫度較低的前期和后期生長更為活躍，與本研究結果較為一致。Scopulibacillus和Staphylococcus的變化趨勢與Bacillus相似。Bacillus在大曲中扮演著至關重要的角色，它們能夠在發酵過程中產生蛋白酶、淀粉酶、糖化酶等關鍵酶類，水解原料中的大分子物質，生成豐富的發酵前體物質，并通過美拉德反應等復雜的生物化學反應促進吡嗪類、酸類、芳香族等對醬香風味貢獻顯著風味物質的形成。而Virgibacillus、Oceanobacillus、Saccharopolyspora、Kroppenstedtia的相對豐度則呈現先上升后下降的趨勢。Virgibacillus在E1中的相對豐度僅為0.37%，在E7中上升到46.48%，在E14中回落到30.93%，并最終在E46中降低到2.09%。這可能是由于大曲制造過程中的兩次翻倉改變了曲塊的溫度和透氣性，從而提高了這些菌屬在大曲中的相對豐度。結果表明大曲制造過程中的兩次翻倉操作對大曲中細菌和真菌的群落組成具有十分顯著的影響。

3 大曲揮發性風味成分分析

在大曲的成型和發酵過程中，微生物的代謝活動導致了大量揮發性化合物的產生。這些化合物直接參與風味化合物的形成或作為前體，對醬香型白酒的品質起著至關重要的作用。對于翻倉操作前后的大曲中的揮發性物質進行了鑒定和定量，并進行Z-score歸一化，繪制熱圖（圖5）。在大曲制造過程中總共鑒定出49 種揮發性物質，包括12 種酯類、9 種吡嗪類、6 種醇類、6 種醛類、5 種酮類、3 種酚類、2 種醚類、2 種呋喃類、1 種烯烴類、1 種酸類及2 種其他物質。酯類物質是高溫大曲中一類重要的揮發性化合物，種類最多。其中正己酸乙酯、辛酸乙酯、棕櫚酸乙酯在大曲發酵過程中含量較高。乙酯是形成白酒典型風味特征的關鍵化合物之一，對白酒的整體風味平衡和層次感起著至關重要的作用。隨著翻倉過程的進行，正己酸乙酯的含量逐漸升高，在E14中達到最大值1 713.61 μg/kg。辛酸乙酯在發酵初期含量較高，為672.01 μg/kg，在E7中顯著降低，在E14中又升高至473.67 μg/kg。經過后續長時間的發酵，在E46中正己酸乙酯和辛酸乙酯的含量均顯著降低。棕櫚酸乙酯有助于減少白酒中的異味和刺激感，對白酒風味有著重要影響。棕櫚酸乙酯的含量在大曲制造過程中呈現出先增加后減少的趨勢，在E1階段，含量相對較低，但在E7階段，棕櫚酸乙酯的含量顯著上升，達到530.09 μg/kg。隨后，在E14和E46階段，棕櫚酸乙酯的含量逐漸下降。除酯類外，醇類物質也是大曲制造過程中的重要揮發性物質。2,3-丁二醇是合成功能物質2,3,5,6-四甲基吡嗪的前體物質，隨著曲塊的發酵含量降低。2-苯乙醇具有玫瑰樣花香，也是中國白酒中非常重要的香氣化合物，在E1中含量為420.70 μg/kg，在E14中達到峰值2 759.90 μg/kg，之后在E46中含量降低到577.74 μg/kg。吡嗪類物質是大曲制造不同階段中最主要的一類揮發性化合物，含量最高，這與鄧阿玲等的研究相符。其中2,3,5,6-四甲基吡嗪約占吡嗪類物質總量的87%～95%。2,3,5,6-四甲基吡嗪含量在大曲制造過程中呈現先減少后增加的趨勢。在初期E1和E7階段，2,3,5,6-四甲基吡嗪的含量較高，隨后在E14階段顯著下降。然而，隨著發酵過程的繼續，特別是在E46階段，2,3,5,6-四甲基吡嗪的含量再次顯著上升，達到整個制造過程中的最高值。在大曲進行第二次翻倉操作之后，檢測到更多種類的風味物質，例如呋喃類、醚類、醛類物質。呋喃類物質通常具有獨特的焦香、豆香，醚類物質則具有獨特的香氣，豐富了香氣種類，而醛類物質則主要提供果香和奶香，例如苯乙醛具有甜香和花香，壬醛則具有油脂、甜橙味，這些風味物質在大曲的制造過程中被轉化與富集，可增加基酒風味的復雜性與層次感。綜上所述，生產過程對大曲揮發性風味成分的形成具有決定性影響，是塑造醬香型白酒獨特風味的關鍵環節。

4 微生物與揮發性風味成分之間的相關性分析

在大曲的制造過程中，兩次翻倉操作會導致微生物豐度動態波動，而不同微生物的生命代謝活動也影響了揮發性風味成分的動態變化。分析微生物與風味成分之間的關系有助于識別潛在的功能微生物群，并適當調控大曲制造過程的風味形成。制造過程不同階段的大曲樣品中的揮發性成分與微生物（屬）之間的潛在關聯關系通過Spearman相關性分析進行了評價。圖6A展示了優勢真菌屬與揮發性風味成分的相關性熱圖。大部分真菌屬與三甲基吡嗪、3,5-二乙基-2-甲基吡嗪、2,3-丁二醇、2,3-丁二酮、2,3,5,6-四甲基吡嗪等吡嗪類物質及其前體物質呈正相關，包括Aspergillus、Rhizopus、Rhizomucor、Alternaria、Byssochlamys、Wallemia、Epicoccum、Wickerhamomyces、Apiotrichum。這些真菌屬與正己酸乙酯、乙酸苯乙酯、9,12-十八碳烯酸正丙酯、棕櫚酸乙酯等酯類物質以及異戊醇、苯甲醇等醇類物質呈負相關。Thermoascus和Thermomyces則與之相反，它們與酯類物質和醇類物質正相關，而與吡嗪類物質呈負相關。Pichia和unclassified_o_Saccharomycetales與2,3,5,6-四甲基吡嗪、苯乙醛和壬醛呈正相關，與異戊酸呈負相關。

圖6B中的結果顯示，Virgibacillus、Oceanobacillus、Saccharopolyspora、Kroppenstedtia、高溫放線菌屬（Thermoactinomyces）與正己酸乙酯、反油酸乙酯、棕櫚酸乙酯、亞油酸乙酯等酯類物質呈正相關，而與白酒中的重要風味物質2,3,5,6-四甲基吡嗪及其前體物質乙偶姻、2,3-丁二酮、2,3-丁二醇都呈負相關。而其他細菌屬如Scopulibacillus、Pediococcus、Kosakonia、Staphylococcus、unclassified_o_Chloroplast和Weissella則與酯合成表現出負相關，而與2,3,5,6-四甲基吡嗪及其前體物質表現出正相關。此外，Oceanobacillus和Kroppenstedtia還與愈創木酚、3-苯基呋喃、2,3-二氫苯并呋喃、鄰苯二甲醚、4-甲基苯甲醚以及大部分醛類物質都呈正相關。細菌屬Bacillus與2,3,5,6-四甲基吡嗪、苯乙醛和壬醛的代謝合成呈正相關。

綜合分析結果表明，細菌屬中的Virgibacillus、Oceanobacillus、Saccharopolyspora、Kroppenstedtia、Thermoactinomyces以及真菌屬中的Thermoascus和Thermomyces對于酯類物質的合成具有重要貢獻，而Thermoascus和Thermomyces則有助于醇類物質的合成，為酯類物質的合成提供了原材料，這可能是它們對于酯類物質的合成表現出正相關的根本原因。而細菌屬中的Scopulibacillus、Pediococcus、Kosakonia、Staphylococcus、unclassified_o_Chloroplast、Weissella和Bacillus以及大部分真菌屬都有助于吡嗪類物質的合成。此外Oceanobacillus和Kroppenstedtia有助于合成呋喃類、醚類以及醛類物質，Bacillus、Pichia和unclassified_o_Saccharomycetales有助于合成苯乙醛和壬醛。

在大曲發酵過程中，微生物快速生長產生大量的生物熱，導致發酵谷物的溫度升高。溫度是大曲微生物群落演替主要環境理化驅動因子，隨著時間的推移，溫度變化對微生物群落和風味物質的形成產生了顯著的影響。在翻倉過程中，大曲溫度升高，為耐熱微生物如Thermoascus和Thermomyces提供了適宜的生長條件，促進了這些微生物的增殖，從而在微生物群落中占據了優勢。同時，高溫環境增強了微生物的代謝活動，導致大量揮發性風味物質的產生，尤其是酯類物質的合成顯著增加，如正己酸乙酯和辛酸乙酯等，這些物質對白酒的風味品質至關重要。隨著翻倉次數的增加，曲塊內的溫度變化促使微生物群落結構發生調整，同時風味物質的種類和含量也隨之變化，例如在第二次翻倉后，呋喃類、醚類、醛類等更多種類的風味物質被檢測到，增加了風味的復雜性與層次感。因此，翻倉操作通過調節大曲的溫度環境，不僅影響了微生物群落的演替，也驅動了風味物質的形成和變化，對醬香型白酒獨特風味的形成起到了重要作用。

5 結論

本研究比較了醬香型大曲制造過程兩次翻倉操作前后的微生物群落演替以及揮發性風味物質的變化。這兩次翻倉過程導致了大曲體系中微生物的重新分布以及微生物群落的調整與重組。其中Virgibacillus、Oceanobacillus、Saccharopolyspora、Kroppenstedtia、Thermoascus和Thermomyces在兩次翻倉過程中相對豐度顯著增加。翻倉操作后大曲曲塊中的正己酸乙酯、辛酸乙酯和2,3,5,6-四甲基吡嗪含量上升，且有更多種類的風味物質被檢測到，例如呋喃類、醚類、醛類物質等。結果顯示大曲曲塊內的釀造核心功能微生物群落的更迭影響了其揮發性風味物質的合成。相關性分析表明，Oceanobacillus、Kroppenstedtia、Thermoascus和Thermomyces與正己酸乙酯合成呈正相關。此外，許多低豐度真菌屬和細菌屬如Staphylococcus及Pichia等都與2,3,5,6-四甲基吡嗪的合成呈正相關。本研究初次探討了醬香型高溫大曲制備過程中兩次翻倉操作對于曲塊發酵過程的微生物群落以及風味物質形成的影響，對于深入理解大曲內微生物群落演替與發展驅動發酵進程的風味等物質代謝規律，探究醬香型高溫大曲生物學特性的品質差異根源以及影響醬酒釀造風味物質形成規律提供基礎數據，為高溫大曲生產制定有效工藝策略提高品質穩定性提供重要參考。

作者簡介

通信作者

李秀婷，教授，女，工學博士，北京工商大學食品與健康學院教授，博士生導師，北京市三八紅旗獎章以及茅以升北京青年科技獎獲得者。中國農業工程學會農產品加工及貯藏工程分會常務理事、副秘書長，中國食品科學技術學會酶制劑分會理事，中國食醋產業技術創新戰略聯盟理事。主要從事傳統發酵食品應用基礎、新型酶資源及功能微生物挖掘、酶分子特性及催化機制、食品酶資源應用及功能性食品研發等方面的研究工作。近年來，主持或完成國家自然科學基金重點項目1 項，面上項目5 項，國家重點研發計劃課題2項及企業合作研發項目多項。以第一或通信作者在《Trends in Food Science & Technology》《Food Hydrocolloids》《International Journal of Biological Macromolecules》《Food Research International》等SCI期刊發表學術論文百余篇；出版學術專著2部，主編教材2部；授權國家發明專利30余件；作為第一完成人獲中國商業聯合會科技進步特等獎、神農中華農業科技獎二等獎、教育部高等學校科學研究優秀成果獎（科學技術）二等獎等各1 項。

第一作者

丁澤，男，北京工商大學食品與健康學院2022級碩士研究生，專業是食品科學與工程，研究方向為微生物與酶工程。在研究生期間參與國家自然科學基金重點項目1 項。目前以第二作者在《International Journal of Biological Macromolecules》國際期刊發表研究文章1 篇。

本文《醬香型高溫大曲制作過程中微生物群落演替規律與風味物質變化》來源于《食品科學》2025年46卷第11期115-124頁，作者：丁澤，陳曦，李金洋，牛家亮，杜秉昊，李微微，龍堯，郎瑩，孫寶國，李秀婷。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20241114-109點擊下方閱讀原文即可查看文章相關信息。

實習編輯：安宏琳；責任編輯：張睿梅。點擊下方閱讀原文即可查看全文。圖片來源于文章原文及攝圖網

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