細菌耐藥性已成為全球公共健康面臨的重大挑戰，其中一個核心問題是細菌如何在抗生素壓力下迅速進化出耐藥表型。傳統認識認為，抗生素通過其特定的作用靶點發揮殺菌作用，但越來越多的研究表明，抗生素還可能通過誘導DNA損傷和活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）產生，觸發細菌的一系列應激反應【1】。

在這些應激反應中，SOS反應是一種經典的DNA損傷修復機制，依賴于recA基因的激活。該過程可以啟動多條DNA修復通路，幫助細菌在抗生素壓力下生存【2】。然而，SOS反應也可能帶來“雙刃劍”效應：一方面，DNA損傷本身可能導致突變累積；另一方面，SOS介導的應急修復機制可能導致錯誤修復，從而加速產生耐藥突變。

針對SOS反應及recA在細菌耐藥性進化中的作用，已有研究主要集中于氟喹諾酮類抗生素，發現單次暴露即可在RecA依賴下顯著促進耐藥性的產生，表明RecA和SOS反應在該過程中發揮關鍵作用【3】。然而，β-內酰胺類抗生素與氟喹諾酮在作用機制和SOS誘導能力方面存在顯著差異。現有模擬進化研究（如適應性實驗室進化，ALE）顯示，大腸桿菌通常需要經歷多輪β-內酰胺抗生素暴露才能逐漸獲得耐藥性【4】。

在短期、單次β-內酰胺抗生素暴露下，RecA及其介導的SOS反應是否參與快速耐藥性形成，尚缺乏系統研究。對此，悉尼科技大學金大勇團隊最新發表的研究工作，首次揭示了一個與經典路徑不同的、RecA缺失背景下細菌如何在極短時間內獲得多藥耐藥性的全新機制，為重新理解抗生素壓力下的耐藥進化提供了重要視角。

近日，悉尼科技大學生物醫學材料及儀器研究所金大勇課題組在eLife期刊發表了題為Fast evolution of SOS-independent multi-drug resistance in bacteria的研究論文，揭示了在缺失RecA的情況下，細菌如何在極短時間內快速獲得穩定的多藥耐藥性。

研究發現，在單次氨芐西林暴露后，僅8小時內，RecA缺失的大腸桿菌即可將對β-內酰胺類抗生素的最小抑菌濃度（MIC）提高多達20倍，表現出穩定的耐藥表型。這一過程不依賴于傳統的SOS反應，而是由兩大進化驅動力共同驅動：一是突變供給的增加，二是抗生素選擇壓力的增強。

機制上，RecA缺失不僅削弱了DNA修復能力，同時顯著抑制抗氧化防御基因的表達，導致細胞內ROS的大量積累。ROS進一步促進耐藥突變的產生，而抗生素選擇壓力則加速了稀有耐藥突變體的擴增。該研究挑戰了“通過抑制RecA/SOS通路可阻止細菌產生耐藥性”的傳統認知，提出“修復缺陷-氧化失衡”作為細菌耐藥演化的新機制，為開發靶向進化驅動力的抗耐藥策略提供了全新思路。

為探究SOS反應在細菌對β-內酰胺類抗生素進化過程中的作用，研究人員以大腸桿菌MG1655為模型，構建了recA缺失突變株（ΔrecA）。在為期三周的適應性實驗室進化（ALE）實驗中，細菌每天接受50?μg/mL氨芐西林處理4.5小時，結果顯示，ΔrecA菌株平均在第2天即出現顯著耐藥，而野生型對照菌株則至少需要兩周才能獲得相似水平的耐藥性。更令人驚訝的是，在僅一次、8小時的氨芐西林處理后，ΔrecA菌株即表現出耐藥性。該快速進化現象不僅限于氨芐西林，在青霉素G和羧芐西林等其他β-內酰胺抗生素處理下也觀察到了類似結果。進一步分析表明，所獲得的耐藥性在無藥壓力下仍可穩定遺傳，說明其具備遺傳基礎。這些結果表明，即使是一次性、短時間的β-內酰胺抗生素暴露，也足以驅動recA缺失菌株產生穩定的耐藥進化（圖1），這一發現對理解SOS反應缺失背景下的細菌耐藥性形成機制具有重要意義。

圖1

另一方面，一個關鍵問題是：ΔrecA菌株的快速耐藥性究竟源于整體突變率的提升、抗生素選擇壓力的增強，還是二者的共同作用？為此，研究者在有無氨芐西林處理條件下，系統分析了ΔrecA菌株的突變頻率及其分布特征。在96個獨立培養體系中，ΔrecA菌株呈現出高度偏斜的突變分布，表現出典型的“幸運瓶頸”現象（jackpot cultures），即少數培養物中出現了突變的大量富集。盡管如此，非參數統計分析顯示，ΔrecA的處理組與未處理組之間的整體突變頻率差異并不顯著 （圖2）。

圖2

這一結果提示，快速獲得耐藥性的機制更可能由抗生素選擇作用驅動，而非廣泛誘變所致。為了進一步驗證這一假設，研究者采用最大似然估計法（MLE）【5】對各組突變率（每個培養體系中的突變數）進行了建模分析。結果發現，ΔrecA處理組的突變率估計值顯著上升，且其基礎突變率相較于野生型也略有增加。最后，結合Luria–Delbrück經典模型【6】，研究者構建了波動實驗（fluctuation test）推理框架。分析表明，ΔrecA菌株在抗生素處理后的突變分布不符合均一誘變的假設，而是支持這樣一個模型：β-內酰胺抗生素的選擇性壓力富集了早期出現的、稀有的耐藥突變亞群體。

進一步研究發現，在ΔrecA菌株中確實存在特定的、與耐藥性密切相關的突變被抗生素選擇性富集。研究人員對獲得的耐藥性單克隆菌株進行了全基因組測序，結果顯示：所有ΔrecA耐藥株均攜帶已知的抗生素耐藥相關突變。其中不僅包括與β-內酰胺抗生素密切相關的經典突變位點，如ampC啟動子區上調突變及其編碼的靶蛋白PBP3對應的ftsI突變，還識別出涉及多重耐藥機制的關鍵突變，如AcrAB-TolC外排系統的acrB位點突變【7】。藥物敏感性測試進一步證實了這些突變的功能性：這些ΔrecA耐藥克隆不僅對氨芐西林耐藥，同時對氯霉素和卡那霉素等其他類別抗生素也表現出明顯的MIC升高，表明單次β-內酰胺暴露即可誘導多重耐藥表型的出現。

DNA修復能力的缺陷通常與突變積累密切相關，而RecA最為人熟知的功能是調控SOS反應。因此，研究人員首先探究了ΔrecA菌株中快速獲得耐藥性是否是由于SOS反應缺失所致。為驗證這一假設，研究者對多個SOS通路關鍵基因突變株進行了相同的β-內酰胺抗生素處理，結果發現這些突變株均未表現出類似的快速耐藥進化，提示ΔrecA菌株中的耐藥性獲得并非由SOS通路缺失介導。進一步地，為評估DNA修復功能的變化，研究團隊采用單分子定位顯微鏡（SMLM）對DNA聚合酶I（DNA Pol I）及其在染色體上的定位進行了高分辨率成像分析。結果顯示，在藥物處理4小時后，ΔrecA菌株中DNA Pol I的表達水平顯著下降，且其與染色體的共定位比例也明顯低于野生型對照。這些數據表明，RecA在調控DNA修復與突變積累過程中所發揮的作用遠超SOS反應本身。ΔrecA菌株中出現的非SOS依賴性DNA修復障礙可能引發基因組不穩定性增加，從而促進耐藥突變的快速出現與富集。

為進一步解析本研究中觀察到的β-內酰胺類抗生素耐藥性快速進化機制，研究人員對氨芐西林處理前后的細菌進行了全轉錄組測序（total RNA-seq）分析，以探究基因表達的系統性變化。差異表達基因（DEGs）分析顯示，藥物處理誘導的大多數轉錄響應與抗生素應激和細菌持留態（persistence）密切相關，包括群體感應、鞭毛組裝、生物膜形成和趨化運動等通路。值得關注的是，在ΔrecA菌株中，多個抗氧化相關基因（如 cysJ、cysI、cysH、sodA 和 sufD）的表達僅在藥物處理后表現出顯著下調。這一抗氧化系統受損可能導致細胞內活性氧（ROS）水平異常升高，進而誘發突變。為驗證這一點，研究人員使用熒光探針 DCFDA/H?DCFDA 結合流式細胞術檢測ROS積累情況。結果顯示，在氨芐西林處理8小時后，野生型和ΔrecA菌株均表現出ROS水平升高，但ΔrecA菌株處理組的ROS積累顯著更高，且與轉錄組數據中抗氧化基因表達下調高度一致。進一步實驗顯示，外源添加抗氧化劑谷胱甘肽（GSH）不僅有效阻斷了ROS的積累，同時也顯著抑制了ΔrecA菌株耐藥性的獲得（圖6），表明ROS在突變產生和耐藥進化中發揮關鍵作用。

此外，轉錄組分析還揭示了多個DNA修復相關基因的表達變化，特別是堿基切除修復（BER）通路【8】。過量ROS可將dGTP氧化為8-oxo-dGTP，誘發堿基錯配和SNP突變。BER通路中的關鍵酶如 MutH、MutY 和 MutM 負責識別并修復這些突變，但在ΔrecA菌株中，這些基因在藥物處理后同樣出現顯著下調。這種廣泛的轉錄下調提示可能存在轉錄抑制因子的激活。研究者在ΔrecA菌株中發現了上調表達的典型轉錄抑制因子H-NS，其已被報道可通過染色質重塑間接抑制多種抗氧化基因的表達，可能在此過程中發揮關鍵調控作用（圖6）。

圖6

總體而言，盡管SOS反應及其核心調控因子RecA在細菌抗生素耐藥性進化中的作用已被廣泛報道，本研究卻首次發現：在E. coli ΔrecA菌株中，僅一次β-內酰胺抗生素暴露即可誘導快速且穩定的多重耐藥性進化。這一現象無法用傳統SOS反應介導的誘變模型解釋，而是源于DNA修復功能缺陷與氧化應激增強這兩大進化驅動力的協同作用。在RecA缺失背景下，細菌DNA修復能力受損，同時抗氧化防御通路受到抑制，導致ROS積累和基因組不穩定性上升，從而顯著提高了產生耐藥突變的概率，并在抗生素選擇壓力下促進耐藥克隆的擴張。這一發現揭示了非SOS依賴性耐藥進化通路，為理解細菌在抗生素壓力下的適應性進化提供了新機制。

正如《eLife》期刊編委所評價：“This study presents a valuable observation of how deletion of a major repair protein in bacteria can facilitate the rise of mutations that confer resistance against a range of different antibiotics.”

悉尼科技大學理學院講師張樂博士和博士生管運鵬為該論文的共同第一作者，悉尼科技大學工程與信息技術學院高級講師蘇乾和悉尼科技大學生物醫學材料及儀器研究所（IBMD）金大勇教授為論文的共同通訊作者。

原文鏈接：https://elifesciences.org/articles/95058

制版人：十一

參考文獻

1.Zhao X, Drlica K. Reactive oxygen species and the bacterial response to lethal stress.CurrOpinMicrobiol.21, 1-6 (2014).

2.?gur-Bertok D. DNA Damage Repair and Bacterial Pathogens.PLOS Pathogens.9 PLOS Pathogens, e1003711 (2013).

3.Barrett, T.C., Mok, W.W.K., Murawski, A.M. et al. Enhanced antibiotic resistance development from fluoroquinolone persisters after a single exposure to antibiotic.Nat Commun.10, 1177 (2019).

4.Levin-Reisman I, Ronin I, Gefen O, Braniss I, Shoresh N, Balaban NQ. Antibiotic Tolerance Facilitates the Evolution of Resistance.Science.355, 826-830 (2017).

5.Zheng Q. Progress of a half century in the study of the Luria–Delbrück distribution.Mathematical Biosciences, 162, 1-32 (1999).

6.Foster PL. Stress-induced mutagenesis in bacteria.Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology, 42, 373–397 (2007).

7.El Meouche I, Dunlop MJ.. Heterogeneity in Efflux Pump Expression Predisposes Antibiotic-Resistant Cells to Mutation.Science.362, 686-690 (2018).

8.Foti JJ, Devadoss B, Winkler JA, Collins JJ, Walker GC. Oxidation of the guanine nucleotide pool underlies cell death by bactericidal antibiotics.Science.336(6079): 315-319 (2012).

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