大家好，今天分享一篇發表在ACS nano上的文章，題目為“Anchoring of Probiotic-Membrane Vesicles in Hydrogels Facilitates Wound Vascularization”。文章的通訊作者是四川大學王啟光副研究員和樊渝江教授，王啟光主要研究方向有軟骨缺損的再生修復材料與人工細胞的仿生構建等；樊渝江教授主要研究方向：基于3D打印技術的生物活性材料在骨骼（顱頜面、脊椎、關節等）再生修復中的應用；細胞來源外泌體在骨關節炎治療中的應用及產品開發，生物醫用高分子填充及輔料產品研究；裝載藥物、基因以及生物活性成分的高分子靶向傳遞系統開發等。

血管化是傷口愈合中的一個關鍵過程，促進新血管網絡的形成，為組織重塑和修復提供必需的營養。早期階段的快速血管化顯著影響組織再生，并影響免疫調節、細胞繁殖和遷移等有益過程，它們共同提高了愈合質量。因此，血管形成已成為治療效果的關鍵指標。最近的研究強調了益生菌在傷口愈合中的功效，特別是通過調節炎癥、促進血管生成和幫助組織再生。而且益生菌可以釋放有機酸、外來體、酶等生物活性分泌物。

作者之前的研究還證明了羅伊氏乳桿菌在傷口修復中的成本效益和實用性。然而，由于益生菌的免疫原性及其在接觸體液時引起額外炎癥的可能性，從益生菌中提取活性成分提出了一種新的策略。有趣的是，細菌，就像其他細胞一樣，釋放可以影響各種生物過程的膜囊泡（MV）。細菌MV的產生具有成本效益且在不同溫度下穩定，使其有利于生物制藥應用。目前，細菌MV可安全地用作疫苗佐劑和天然疫苗。因此，可以合理地假設源自L. reuteri可能提供一種更安全的替代方案，具有保留傷口愈合能力。這種方法可能在組織修復生物材料的開發中更具競爭力。目前，細菌MV可安全地用作疫苗佐劑和天然疫苗。因此，作者可以合理地假設源自L. reuteri可能提供一種更安全的替代方案，具有保留傷口愈合能力。這種方法可能在組織修復生物材料的開發中更具競爭力。

水凝膠具有類似于細胞外質（EM）的獨特三維網絡結構，在傷口愈合期間提供支持和保護，并作為將治療劑輸送到損傷部位的平臺。作者從羅伊氏菌（LMV）并使用N-羥基丁二醇二胺（NHS）-馬來酸（MAL）作為介體將它們錨定到羥化殼聚糖（CS）中，以構建用于血管生成和傷口修復的益生菌-MV水凝膠（Gel-LMV）（方案1）。LMV保持了增強細胞增生和血管生成的能力，而不會誘導額外的炎癥。一旦整合到水凝膠中，LMV就會與凝膠的降解同步以受控的方式釋放，通過調節關鍵信號途徑（包括缺氧誘導因子1（希夫-1）途徑）促進人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）的血管形成。體內研究證實，Gel-LMV在傷口愈合早期有效促進血管新生，并增加人血管內皮細胞粘附分子（CD 31）的表達，加速愈合過程。這項研究為設計基于益生菌MV的生物材料提供了一種先進的策略，以增強傷口愈合應用。

LMV的合成與特性

大規模培養羅伊氏菌，并分離上清以進一步加工（圖1A）。為了探索LMV的潛在生物學能力，在本研究中進行了mRNA測序轉錄組。LMV參與調節“MEK信號途徑”、“Rap 1信號途徑”和“希夫-1信號途徑”。這些發現表明，LMV在促進傷口愈合方面具有顯著優勢，特別是通過促進血管生成。因此，作者將一組靶基因與參與傷口修復的基因雜交，以獲得共同的基因集（圖1F）。基于這些共享基因及其在LMV中相應的mRNA表達水平，作者確定了前10種高表達的mRNA，并具有許多相應的靶點（圖1G）。最后，為這些靶基因構建了基因相互作用網絡（圖1H），揭示了潛在的樞紐基因，例如成纖維細胞生長因子2（GF 2）、血管內皮生長因子A（VEGFA）和血小板源性生長因子亞基（BPDGFB）等。為了評估LMV對細胞行為的影響，為體外細胞實驗建立了一系列LMV濃度梯度（圖1 I），并使用BCA方法量化LMV的濃度。為了關注應用中的生物安全性，確定HUVECs和L929細胞促進細胞繁殖的最大濃度為20 μg/mL（圖1 J）。

圖1

Gel-LMV的合成與特性

凝膠水凝膠是通過CSC和氧化透明質酸（OHA）之間的希夫堿反應合成的，具有合適的三維網絡結構和生物相容性。作為對照，通過物理復合合成負載LMV的凝膠水凝膠（凝膠/LMV），水凝膠合成中LMV的最佳濃度為20 μg/mL。LMV的修飾沒有顯著改變凝膠的原始結構（圖2B）或流體動力學（圖S11），也沒有影響降解行為（圖2C）。共焦顯微鏡顯示Gel-LMV內LMV的均勻分布和增強的加載效率（圖2D）。LMV組的延長釋放證實了LMV成功移植到GelLMV中的水凝膠上（圖2 E）。

圖2

Gel-LMV在體外減弱血管形成和增生

在評估Gel-LMV的潛在性能時，作者描述了水凝膠對體外細胞行為的直接影響，包括增生、遷移和管狀形成（圖2F）。如圖2G所示，凝膠顯示出良好的生物相容性，但沒有細胞毒性，盡管其顯著促進細胞增生的能力有限且與對照組相當。然而，當LMV錨定在凝膠上時，與單獨的凝膠相比，Gel-LMV可以在更長的時間內有效地促進細胞繁殖。作為傷口愈合期間表皮再生的模型，劃痕傷口愈合試驗表明，Gel-LMV誘導更多細胞遷移到水凝膠的位置，表明其有潛力促進水凝膠插入部位的組織再生（圖2 H）。此外，Gel-LMV保持了持久的生物相容性，促進細胞繁殖（圖3A、B）。在細胞劃痕模型中，L929細胞在24小時時GelLMV的閉合率超過60%（圖3C）。此外，用于評估血管形成能力的材料膠管形成試驗表明，與凝膠處理的HUREC相比，Gel-LMV的總節段長度 顯著更高（圖3D）。在遷移試驗中，HUREC的Gel-LMV的閉合率也超過了70%（圖3E）

圖3

為了揭示Gel-LMV如何影響細胞活性的潛在機制，在與HUVECs共培養3天后進行了RNA測序。主成分分析表明，Gel和Gel-LMV之間的基因表達存在顯著差異，GO分析表明，Gel-LMV中上調的基因與細胞增生、遷移和生長因子表達相關，與LMV的作用密切一致（圖4A）。下調的基因表明細胞死亡減少（圖4 B）。KEGG分析表明，相關途徑的調節集中在對血管形成積極的活動上，例如希夫-1信號途徑、糖分解/糖異生和碳代謝（圖4C）顯示了特定基因熱圖和基因途徑相互作用弦圖（圖4D、4 E），以及與血管再生相關的基因表達，包括磷酸果苷酶（PFKL）、阿卜杜拉酶A（ALDOE）、磷酸丙糖同工酶（TIP）等，已識別（圖4F）。為了進一步證實Gel/LMV在血管生成相關途徑中的調節作用，用KC 7 F2抑制了希夫-1信號途徑。與單獨使用GelLMV相比，Gel-LMV的血管新生能力顯著降低，證實了該途徑的重要性（圖4 H）。總而言之，這些結果表明Gel-LMV有潛力通過調節關鍵信號途徑中的基因表達來增強血管生成和其他再生生物學活性。

圖4

Gel-LMV體內治療全層皮膚損傷模型

圖5

本研究介紹了L.將羅伊氏菌膜小泡（LMV）轉化為新型益生菌-MV水凝膠，通過將LMV化學嫁接到水凝膠網絡中來實現。LMV的生物活性在水凝膠中得到有效保留，確保持續控制釋放并促進基因調節劑的分泌，從而增強細胞的繁殖、遷移和血管生成。這最初是通過轉錄組分析確定的，并在體外進一步驗證。與傳統商業應用相比，益生菌-MV水凝膠表現出更好的血管化能力，導致傷口部位的皮膚組織顯著再生。總體而言，該策略為開發益生菌MV作為促進血管生成的潛在治療方法提供了寶貴的見解，并擴大了益生菌MV的生物醫學應用。

DOI: 10.1021/acsnano.4c11986

原文鏈接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acsnano.4c11986