【寫在前面】：本期推薦的是由上海中醫藥大學附屬曙光醫院等研究團隊近期發表于Journal of Ethnopharmacology(IF4.8）的一篇文章，揭示基于轉錄組學與分子生物學技術探究雙夏湯抑制神經炎癥減輕5×FAD小鼠睡眠障礙的機制研究。

【期刊簡介】

【題目及作者信息】

Shuangxia Decoction attenuates sleep disruption in 5×FAD mice through neuroinflammation inhibition: An integrative analysis of transcriptomic and molecular biology investigations

民族藥理學相關性：阿爾茨海默病（AD）是一種以記憶和學習障礙為特征的神經退行性疾病。晝夜節律紊亂導致的睡眠障礙在AD患者中十分常見。由半夏（Pinellia ternata (Thunb.) Breit.）和夏枯草（Prunella vulgaris L.）組成的雙夏湯（SXD）千百年來已被有效用于治療睡眠障礙。然而，SXD通過晝夜節律相關途徑治療AD的機制尚未被深入探究。

研究目的：本研究旨在通過綜合方法確定SXD在治療AD方面的療效、機制及活性成分。

材料與方法：我們對野生型（WT）小鼠進行慢性時差（CJL）處理，并監測其休息/活動情況，比較WT、CJL以及CJL + SXD各組小鼠的休息/活動周期。此外，我們通過行為學測試和硫黃素染色評估SXD對5×FAD小鼠認知功能和Aβ負荷的影響。通過轉錄組學和生物學實驗驗證揭示SXD的作用途徑。利用超高效液相色譜-質譜（UPLC-MS）、分子對接和細胞熱位移實驗（CESTA）對SXD的活性成分進行分析。

結果：本研究結果顯示，CJL小鼠在SXD治療后休息/活動周期迅速恢復。此外，SXD治療減輕了5×FAD小鼠大腦中Aβ斑塊的積累，從而保護了其認知行為和運動能力。而且，SXD顯著增強了5×FAD小鼠海馬CA1神經元的突觸可塑性和樹突可塑性。轉錄組學分析顯示，5×FAD小鼠體內與神經炎癥相關的通路上調。后續的熱圖分析顯示，在SXD治療后，5×FAD小鼠體內促炎因子（如Cd68、Trem2、IL-6、IL-1β、Cxc3r1、Tnf等）分泌減少，抗炎因子（如IL4、Ccl19、Ccl21a等）分泌增加。同時，SXD上調了BMAL1、CLOCK等參與晝夜節律的正向調控因子，下調了NR1D1等負向調控因子。此外，在5×FAD小鼠中，小膠質細胞呈現阿米巴樣形態，細胞突起少，細胞體呈圓形，而同齡的SXD處理組小鼠的小膠質細胞則保持分枝狀外觀。本研究還確定了SXD的20種主要成分，并挑選出3-（3,4-二羥基苯基）乳酸、鼠尾草酚苷和冬青海楠素D，進一步與常用的晝夜節律靶點REV-ERBα（NR1D1）進行分子對接。其中，鼠尾草酚苷通過CESTA實驗顯示出與REV-ERBα的強結合能力。

結論：我們的研究結果表明，SXD可能通過特異性結合小膠質細胞中的REV-ERBα來激活BMAL1/CLOCK通路，從而抑制炎癥因子的轉錄，有助于緩解神經炎癥并阻止AD進展，從而挽救5×FAD小鼠的晝夜節律。我們的研究結果為在AD早期開發基于SXD的療法提供了科學基礎，在AD早期，睡眠中斷先于認知能力下降，為臨床試驗提供了潛在的線索，以改善睡眠質量，從而延緩AD患者的神經退行性變。

（圖文摘要）

【前言】

2019年，全球約有5500萬人患有阿爾茨海默病（AD，一種進行性認知障礙），預計到2050年這一數字將增至1.39億。這一增長將影響約5-8%的老年人口，給公共衛生帶來重大挑戰。AD的主要特征包括老年斑（也稱為淀粉樣β（Aβ）斑塊）的形成，這是由于淀粉樣前體蛋白（APP）的異常裂解，以及神經原纖維纏結的發展，這是由于tau蛋白的過度磷酸化。由于AD的病理生理學復雜多變，美國食品藥品監督管理局（FDA）批準的藥物療效有限。鑒于AD的不可逆性，在認知癥狀出現之前進行早期診斷和治療至關重要。

睡眠障礙與AD發病機制之間的復雜雙向關系已越來越受到關注。老年人的睡眠障礙可能是AD早期發病的信號，在前臨床階段影響多達60%的患者。與睡眠模式健康的人相比，睡眠障礙者患AD的風險高出1.55倍，認知能力下降的風險高出1.65倍。這些睡眠障礙往往在疾病早期出現，并隨著AD的發展而惡化，可能作為AD晚期死亡率的重要預測因子。AD中常見的睡眠障礙包括白天過度嗜睡和夜間失眠，這主要歸因于晝夜節律的破壞。5×FAD小鼠，一種廣泛建立的小鼠模型，也表現出白天初始階段2小時的相位延遲和峰值清醒期。

核心分子晝夜節律通過轉錄-翻譯反饋回路發揮作用，涉及BMAL1/CLOCK、抑制蛋白PER和CRY以及核受體RORs和REV-ERBs（REV-ERBα和REV-ERBβ），它們調節BMAL1/CLOCK通路的激活或抑制。BMAL1在人類松果體中呈現節律性表達，但在前臨床和臨床AD患者中這一節律受到干擾。在5×FAD小鼠中也觀察到BMAL1和CLOCK的異常表達，這表明晝夜節律的改變、Aβ病理和tau病理之間可能存在聯系。因此，通過藥物干預靶向與晝夜節律相關的蛋白質，可能有助于通過緩解睡眠障礙來實現AD的早期治療。

最近的AD研究進展強調了神經炎癥在介導睡眠-AD關系中的關鍵作用。小膠質細胞的過度激活與炎癥介質一起，在神經炎癥過程中起著關鍵作用。在中樞神經系統中，小膠質細胞占總細胞數的10-15%，作為免疫細胞和吞噬細胞發揮作用。小膠質細胞的突起具有高度動態性，其激活通常以形態學變化為特征，從高度分支（分枝狀）階段逐漸變為受刺激的阿米巴狀，伴隨表面分子的升高。小膠質細胞的激活，特別是通過NLRP3炎癥小體途徑，已被證明會破壞晝夜節律，同時促進Aβ沉積和突觸功能障礙。先進的研究表明，小膠質細胞驅動淀粉樣β蛋白病，并介導淀粉樣β對tau蛋白病的影響。這種神經炎癥級聯反應形成了一個惡性循環，睡眠障礙加劇神經炎癥，而神經炎癥又惡化睡眠質量，加速神經退行性變。盡管對這一機制有所了解，但目前針對AD相關睡眠障礙的藥物干預仍然有限，通常僅提供癥狀緩解，而未解決潛在的神經炎癥過程，導致藥物依賴。

中醫藥（TCM）含有多種天然化合物和活性成分，在治療伴有睡眠障礙的AD方面具有良好的效果和較少的不良反應。根據中醫藥理論，AD伴有睡眠障礙的主要發病機制歸因于“陰陽失衡”。雙夏湯（SXD），由半夏（Pinellia ternata (Thunb.) Breit.）和夏枯草（Prunella vulgaris L.）組成，歷史上被記載具有鎮靜作用。該方劑記錄于《黃帝內經》中，此后在臨床實踐中被廣泛使用。SXD被認為有助于身體能量的“陰陽平衡”，促進正常生理功能的恢復。從機制上講，SXD通過增加下丘腦5-HT1A和5-HT2A受體，同時降低血清TNF-α水平來發揮治療作用。SXD提取物還具有鎮靜作用。然而，SXD治療是否靶向AD患者的晝夜節律相關軸尚未被研究。

本研究團隊已構建了一個穩定的晝夜節律紊亂小鼠模型，并用于研究疾病進展。在本研究中，我們旨在研究SXD對晝夜節律相關蛋白的影響及其與神經炎癥的潛在聯系。首先，我們使用5×FAD小鼠，這是一種在AD前病理階段表現出睡眠障礙的AD小鼠模型，并進行行為實驗和Aβ染色，以分析SXD在治療AD病理方面的作用。隨后，我們進行了RNA-seq分析和實驗驗證，以闡明SXD在AD中的作用機制。最后，我們采用UPLC-Q-TOF-MS檢測SXD在AD治療中的潛在成分。我們的研究工作框架如圖解摘要所示。通過系統研究SXD的多靶點機制，我們的研究加深了對中醫藥在AD治療中的理解，并為睡眠、神經炎癥和神經退行性變之間的復雜相互作用提供了新的見解。

【結果】

1、慢性時差（CJL）小鼠接受雙夏湯（SXD）治療后活動周期和幅度的快速恢復

我們構建了一種慢性時差（CJL）模型，觀察雙夏湯（SXD）對睡眠障礙的影響。小鼠重新暴露于標準光照條件下（LD），期間繼續接受SXD（中劑量5克/千克）或水處理。

通過分析運動活動，我們證實CJL模型破壞了野生型（WT）小鼠的晝夜活動規律。SXD治療后活動規律發生改變。此外，光照小鼠（LD）表現出約24小時的晝夜節律周期，而CJL小鼠在置于光照條件（LD）下4天后，其活動周期逐漸接近LD組，但波動范圍更大。相反，CJL + SXD組在置于光照條件（LD）下僅1天后就迅速恢復了活動周期，到第3天時，其活動周期已非常接近LD組。

此外，CJL降低了小鼠的活動幅度，而SXD治療恢復了降低的幅度。我們的研究表明，SXD在CJL后能夠快速恢復周期和幅度，為中醫藥在治療晝夜節律紊亂中的潛在應用提供了有力支持。

2、雙夏湯（SXD）提高了5×FAD小鼠的認知功能

我們進一步利用幾種行為測試，評估了不同劑量（2.5克/千克、5克/千克和7.5克/千克）的SXD對5×FAD小鼠學習和記憶能力的改善效果。在藥物治療3個月后，對每組小鼠進行了新物體識別（NOR）和水迷宮（WMW）測試。NOR是一種基于小鼠探索新物體的固有傾向的記憶和學習測試。通過識別指數（RI，計算公式為：新物體識別次數/總識別次數×100%）來評估它們對新奇性的識別。

結果顯示，在1小時的識別過程中，5×FAD組的RI較WT組降低，而在5×FAD-SXD-M和5×FAD-SXD-H組中得到改善。然而，5×FAD-SXD-L組未見變化。此外，在24小時測試點，三組間未見顯著差異。為了評估空間學習和記憶能力，我們對每組小鼠進行了標準的水迷宮（MWM）測試。

結果顯示，在5×FAD組中，與WT組相比，尋找隱藏平臺的逃脫潛伏期在第5天和第6天增加，平臺移除后穿越平臺的次數在第7天減少。而5×FAD-SXD-H組在第5天和第6天到達隱藏平臺的逃脫潛伏期減少，第7天穿越平臺的次數恢復。相比之下，5×FAD-SXD-L和5×FAD-SXD-M組未見顯著變化。NOR和MWM測試結果表明，中高劑量的SXD可以顯著改善學習記憶障礙，并逆轉5×FAD小鼠在AD病程中的空間記憶衰退。

3、雙夏湯（SXD）顯著抑制大腦中Aβ的沉積

阿爾茨海默病（AD）患者及5×FAD小鼠大腦的一個關鍵病理特征是β-淀粉樣蛋白（Aβ）的積累。如圖3A-D所示，我們觀察到5×FAD小鼠的大腦皮層和海馬體（尤其是CA1和齒狀回（DG）區域）中斑塊面積分數（%）增加。相比之下，5×FAD-SXD-H和5×FAD-SXD-M小鼠與5×FAD小鼠相比，Aβ沉積顯著減少，而5×FAD-SXD-L組未觀察到顯著變化。這些結果表明，SXD處理可能以濃度依賴性方式減少大腦皮層和海馬體中的Aβ斑塊積累。

4、雙夏湯（SXD）顯著增強了5×FAD小鼠CA1神經元的突觸可塑性和樹突可塑性

鑒于在高劑量SXD組中觀察到了顯著的治療效果，后續研究將集中在這個劑量上。由于突觸通常被認為是學習和記憶的細胞基礎，我們采用高爾基染色法來評估SXD是否會影響突觸可塑性，包括樹突棘的密度以及突觸的數量。SXD處理可以逆轉5×FAD小鼠CA1區域錐體神經元復雜度和樹突長度的減少（圖4B和C）以及樹突棘密度的降低（圖4D和E）。此外，腦源性神經營養因子（BDNF）通過促進長期增強（LTP）和調節突觸傳遞來增強突觸可塑性，從而支持學習和記憶過程（樸和蒲，2013）。我們發現，在SXD處理后，5×FAD小鼠中BDNF水平的降低得到了逆轉（圖4F和G）。這些發現表明，SXD通過增強神經元突觸可塑性，具有治療阿爾茨海默病（AD）的潛力。

5、雙夏湯（SXD）調節5×FAD小鼠的神經炎癥相關通路及保留節律性基因表達

為了深入了解SXD在治療阿爾茨海默病（AD）中的機制，我們對WT（野生型）、5×FAD和5×FAD-SXD-H組的小鼠腦組織進行了RNA測序分析。如圖5A所示，三個組之間的差異表達基因（DGEs）的重疊部分以韋恩圖的形式展示。對RNA測序數據進行主成分分析（PCA）顯示，與WT組相比，5×FAD組的小鼠腦組織具有不同的轉錄組譜，而5×FAD-SXD組與WT組的轉錄組譜則更為接近（圖5B）。通過熱圖展示了RNA測序數據的顯著基因表達譜（圖5C）。KEGG通路分析顯示，在所有實驗組中，炎癥通路顯著富集，例如細胞因子-細胞因子受體相互作用、NF-kappa B信號通路、NOD樣受體信號通路、Toll樣受體信號通路等（圖5D）。

有趣的是，結果主要富集了與神經炎癥相關的通路，而與突觸功能和神經元損傷相關的通路并未顯著富集。隨后的熱圖分析顯示，在5×FAD小鼠中，經過SXD處理后，促炎因子的分泌（如Cd68、Trem2、IL-6、IL-1β、Cxc3r1、Tnf等）受到抑制，而抗炎因子的分泌（如IL4、Ccl19、Ccl21a等）則有所增加（圖5E）。同時，SXD上調了與晝夜節律相關的正向調控因子如Bmal1和Clock，下調了負向調控因子如Nr1d1（圖5F），這表明SXD對神經炎癥的保護作用與調節5×FAD小鼠的晝夜節律有關。

我們通過qPCR、WB和ELISA進一步驗證了RNA測序數據。結果顯示，在5×FAD小鼠中，Bmal1和Clock的mRNA和蛋白質表達顯著下調，而SXD則上調了它們的表達（圖5H和I），這與我們之前的實驗結果一致。此外，ELISA測試顯示，SXD顯著降低了海馬體中促炎細胞因子IL-1β和IL-6的水平（圖5I）。

6、SXD減少小膠質細胞和星形膠質細胞的活化，抑制5×FAD小鼠的神經炎癥反應

我們進一步評估了SXD處理后5×FAD小鼠中靠近Aβ斑塊的小膠質細胞活化情況。此外，利用二維重建量化每個小膠質細胞的總分支長度和分支點數量，以確定小膠質細胞的狀態。與野生型（WT）小鼠相比，5×FAD小鼠大腦中Iba1+小膠質細胞的數量增加了2-3倍，而經過SXD處理后，Iba1+小膠質細胞的數量有所減少。

在5×FAD小鼠中，圍繞斑塊（6E10+斑塊）的小膠質細胞數量呈現出上升趨勢，與WT小鼠相比，斑塊相關Iba1+小膠質細胞水平有所增加（圖6A和B）。SXD處理顯著降低了斑塊相關Iba1+小膠質細胞的數量（圖6A和B）。此外，WT小鼠中的小膠質細胞呈現出高度分支的形態，而在5×FAD小鼠中，它們逐漸轉變為具有回縮突起的變形蟲狀（圖6A-E）。在5×FAD-SXD小鼠中，小膠質細胞的形態更接近于WT組觀察到的形態，盡管它們在一定程度上仍然表現出肥大的跡象。此外，在5×FAD小鼠中，Aβ斑塊聚集在M1型小膠質細胞周圍，而在SXD處理后，隨著小膠質細胞從M1型轉變為M2型，Aβ斑塊逐漸消失。這些結果表明，促炎性的M1型小膠質細胞可能與Aβ的產生有關，而抗炎性的M2型小膠質細胞可能促進Aβ的降解。

7、我們還進行了GFAP染色以識別星形膠質細胞，并觀察到在5×FAD組的皮層、CA1和齒狀回（DG）區域中星形膠質細胞顯著活化，而在5×FAD-SXD組中則顯著減弱（圖7A-D）。上述結果表明，SXD對小膠質細胞的活化具有抑制作用，減少了M1型小膠質細胞的活化狀態，同時促進了具有吞噬形態的M2型小膠質細胞的轉化，并且也抑制了星形膠質細胞的活化，這表明SXD對神經炎癥具有抑制作用。

8、雙夏湯（SXD）的成分與小膠質細胞中的REV-ERBα強結合

為了探究SXD對小膠質細胞晝夜節律的影響，我們進行了免疫熒光（IF）共定位實驗，檢測了與小膠質細胞標記物Iba1相關的重要調節蛋白REV-ERBα和BMAL1，結果表明SXD抑制了REV-ERBα+，同時促進了BMAL1+小膠質細胞的表達（圖8A），這表明SXD可能通過抑制晝夜節律的重要負調節因子REV-ERBα蛋白（通常用作藥物靶點）來挽救AD小鼠的BMAL1/CLOCK通路，從而抑制小膠質細胞的炎癥反應。

我們進一步利用超高效液相色譜-質譜聯用（UPLC-MS）分析了SXD的主要成分，以檢測其成分是否能夠與REV-ERBα蛋白結合。SXD的總離子流圖（BPC）和混合對照物質在正負離子模式下主要化學成分的含量如圖S1所示。我們篩選出了SXD的前20種關鍵成分（表1），并發現了三種最顯著的成分：3-（3,4-二羥基苯基）乳酸、海南黃芩苷D和丹參素（Sal）（圖8B）。

隨后，我們對這些成分與目標蛋白REV-ERBα進行了分子對接，發現所有三種單體成分都與REV-ERBα緊密結合（圖8C）。接著，我們對REV-ERBα和丹參素（Sal）進行了化學計量學溫度變化分析（CETSA），丹參素是夏枯草的成分，可能在認知障礙（盧奇尼馬斯等，2024）和睡眠障礙中發揮作用。隨著溫度升高，蛋白質與丹參素的結合活性明顯比DMSO組更緊密（圖8D）。

上述結果表明，SXD的成分可以與REV-ERBα結合以激活BMAL1/CLOCK轉錄。

SXD（四物湯）作為中醫經典方劑，在臨床治療睡眠障礙方面具有顯著療效。為了進一步驗證SXD在治療阿爾茨海默病（AD）伴睡眠障礙動物模型中的治療效果，我們構建了C57BL/6J（C57）小鼠模型和5×FAD小鼠模型，并對SXD進行處理。通過運動活動分析，我們發現SXD能快速恢復C57小鼠的周期和振幅，并通過新物體識別（NOR）和水迷宮（MWM）行為測試改善AD小鼠的認知能力。

為了進一步在病理水平上驗證其有效性，我們使用硫黃素S（Thio-S）染色觀察大腦區域中的Aβ沉積。我們研究中最顯著的發現是，SXD處理后Aβ沉積顯著減少，這伴隨著行為測試中認知表現的改善。這一觀察結果與最近研究表明中藥具有抗淀粉樣變性的研究結果一致。然而，我們的RNA測序分析揭示了一個意外的模式：雖然與突觸功能和神經元損傷相關的通路并未顯著富集，但我們觀察到與神經炎癥相關的通路發生了顯著變化。這種明顯的差異可能通過AD病理發生的時間動態來解釋，其中神經炎癥變化在疾病早期階段先于明顯的突觸功能障礙。

小膠質細胞被認為具有與AD階段相關的多種反應表型，這可能是促炎性或抗炎性的。在AD的初始階段，抗炎性小膠質細胞，被分類為M2小膠質細胞，受到像IL-4這樣的抗炎細胞因子的刺激。這種刺激導致諸如精氨酸酶-1等的分泌，其具有遷移到損傷位點并隨后清除積累的Aβ的能力。然而，隨著AD的進展，促炎性小膠質細胞（M1型）分泌像IL-1β這樣的多種促炎因子，增強炎癥級聯反應，并最終導致神經元變性和持續的神經炎癥。此外，TREM2與Iba1和CD68相關，這與在淀粉樣相關小膠質細胞中TREM2的上調一致。我們隨后的熱圖分析顯示，在5×FAD小鼠中，SXD處理后促炎性小膠質細胞分泌物（Cd68、Trem2、IL-6、IL-1β、Ccl25、Ccl3、Cxc3r1、Tnf等）受到抑制，而抗炎性小膠質細胞分泌物（IL4、Ccl19、Ccl21a等）增加。我們進一步評估了我們研究中小膠質細胞形態的轉變。我們發現SXD可以減少M1型（淀粉樣相關）小膠質細胞的活化狀態，同時促進吞噬形態M2型的轉化。在斑塊附近觀察到的小膠質細胞Aβ吞噬作用的增加，加上促炎性細胞因子的下調，表明SXD促進了一種神經保護性小膠質細胞表型。小膠質細胞活化對Aβ斑塊的空間分析進一步支持了SXD增強斑塊清除并減輕神經毒性炎癥的假設。

此外，晝夜節律在調節M1型小膠質細胞的活化中起著關鍵作用，從而通過其對免疫反應、吞噬活性和代謝功能的影響影響AD的進展。在AD小鼠模型中，晝夜節律的破壞增強了小膠質細胞的M1極化，導致神經炎癥和AD的進展，而小膠質細胞的清除則減輕了節律破壞引起的認知缺陷。此外，晝夜節律基因的操縱已被發現影響小膠質細胞的功能。值得注意的是，像TNFα、IL-6和IL-1β這樣的主要促炎細胞因子的晝夜表達模式表現出節律性波動。像REV-ERBα和BMAL1這樣的蛋白質在M1小膠質細胞的轉化和功能中起著調節作用。在AD小鼠中，小膠質細胞BMAL1/CLOCK通路的破壞觸發NF-κB通路，導致促炎性基因的異常表達。抑制REV-ERBα減少M1型小膠質細胞的產生，增加M2樣轉化和吞噬作用，并進一步減少Aβ沉積。REV-ERBα激動劑SR9009被發現激活小膠質細胞并增加促炎性基因的表達，最終導致認知功能障礙。相比之下，用拮抗劑SR8278阻斷REV-ERBα被證明促進BMAL1轉錄，并增加小膠質細胞對fAβ1-42的攝取。

綜上所述，這些發現表明，針對REV-ERBs以促進生物晝夜節律的轉錄重塑，是早期AD治療的有希望的策略。在我們的研究中，我們探討了SXD在調節小膠質細胞晝夜節律中的具體作用。我們的結果表明，SXD在小膠質細胞中下調REV-ERBα并上調BMAL1的表達。

我們進行了超高效液相色譜-質譜聯用（UPLC-MS）以進一步探索SXD的關鍵活性成分。我們確定了20種活性成分，其中3-（3,4-二羥基苯基）乳酸、丹參素和海南黃芩苷D的含量排名前三。此外，我們進行了分子對接，發現這些單體都能與REV-ERBα緊密結合。其中，丹參素具有抗病毒、抗氧化、抗炎和免疫抑制的益處，以及在認知障礙中的潛在作用。最新研究表明，丹參素是夏枯草催眠作用的主要成分。因此，我們應用了化學計量學技術（CESTA），這是一種用于研究蛋白質穩定性和蛋白質-蛋白質相互作用的生化技術，發現丹參素在體外與REV-ERBα蛋白結合力很強。這些實驗使我們能夠正確認識作用于晝夜節律相關REV-ERBα/BMAL1負反饋通路的特定化合物。

【結論】

總之，本研究首次通過行為學分析、轉錄組學、分子對接及分子生物學技術揭示了SXD影響并緩解AD的新型藥效機制。我們發現，SXD及其主要成分可能通過與REV-ERBα特異性結合來激活BMAL1/CLCOK通路，從而抑制IL6、IL-1β和TREM2的轉錄，有助于減輕神經炎癥并阻斷AD進展（圖9）。睡眠質量和認知功能的改善表明，SXD在AD早期階段可能特別有益，因為睡眠障礙通常先于認知能力下降。此外，SXD可能通過多方面機制減少Aβ沉積，包括抑制促炎因子以減少Aβ生成，以及促進抗炎小膠質細胞極化以增強Aβ吞噬。這些發現表明，SXD及其活性化合物在減輕AD患者與晝夜節律紊亂相關的病理影響方面具有良好的藥理治療前景。活性成分的鑒定為開發標準化的SXD療法提供了基礎。

然而，本研究仍存在一些局限性。由于SXD通過靶向Rev-erbα改善睡眠障礙以治療AD是一個新發現，我們在選擇陽性對照藥物方面存在一些不確定性。在后續研究中，我們將使用助眠藥、Rev-erba激動劑或拮抗劑作為陽性對照來解決這一局限。此外，在CJL實驗中，每組僅有三只小鼠，與其他實驗相比樣本量較小。然而，以往使用類似模型的研究表明，即使動物數量較少，只要嚴格控制實驗條件，也能獲得一致且可靠的結果。未來可以考慮進行更大樣本量的研究來進一步驗證這些發現。此外，盡管本研究確定了SXD中與REV-ERBα相互作用的三種主要成分，但仍需進一步的實驗驗證來闡明每種成分的貢獻及其潛在的協同效應。未來的研究將包括靶向測定，如劑量-反應實驗和聯合治療，以確定每種成分如何影響REV-ERBα活性，以及它們的聯合效應是否增強或調節對BMAL1/CLOCK轉錄的整體調控影響。

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